【摘要】 目的 评价乌司他丁预先给药对异氟醚暴露致老年小鼠认知功能障碍的影响。方法 健康雄性SPF 级 C57BL /6 小鼠 36 只，18 月龄，体重 27 ～ 35 g，采用随机数字表法，将其分为 3 组( n = 12) ; 空白对照组 ( C组) 、异氟醚组( I 组) 、乌司他丁预先给药组( S 组) 。I 组和 S 组暴露于 1% 异氟醚 3 h，连续 7 d; S 组于异氟醚暴露前 30 min 腹腔注射乌司他丁 50 000 U/kg。末次暴露结束后 24 h 进行认知功能测试，包括 Morris 水迷宫和旷场实验测试，测试完毕后立即处死小鼠取海马，采用 ELISA 法测定白细胞介素 － 6( IL － 6) 、白细胞介素 － 1β( IL － 1β)和肿瘤坏死因子 － α( TNF － α) 含量。结果 与 C 组比较，I 组逃避潜伏期延长，原平台停留时间和穿越平台次数减少，旷场中心区停留时间缩短，海马 IL － 1β、TNF－ α 含量升高( P ＜ 0. 05) ，S 组上述指标差异无统计学意义( P ＞ 0. 05) 。与 I 组比较，S 组逃避潜伏期明显缩短，原平台停留时间和穿越原平台次数增多，旷场中心区停留时间延长，海马 IL － 1β、TNF － α 含量降低( P ＜ 0. 05) 。结论 乌司他丁预先给药可改善异氟醚暴露所致老年小鼠认知功能障碍，其机制可能与抑制海马炎症因子过度释放有关。

【关键词】 异氟醚; 乌司他丁; 老年鼠; 认知障碍; 海马; 炎症

术后认知障碍( POCD) 是老年患者术后常见的并发症之一。研究表明，异氟醚可导致 POCD。因此探寻有效措施预防和**异氟醚导致的认知功能障碍具有重要意义。乌司他丁是从人尿液中分离纯化的广谱蛋白酶抑制剂，可减少炎症介质的过度释放。研究表明，乌司他丁具有神经保护作用，但其能否有效地防治异氟醚所致认知功能障碍尚不明确。本研究拟评价乌司他丁预先给药对异氟醚暴露致认知功能障碍的影响。

1 材料与方法

1． 1 实验动物 健康雄性 SPF 级 C57BL /6 小鼠 36只，18 月龄，雄性，体重 27 ～ 35 g，由中山大学实验动物中心提供，于室内温度 22℃ ，湿度 50% ，12 h/12 h 昼夜明暗交替的环境中饲养。采用随机数字表法，将其分为 3 组( n = 12) ; 空白对照组( C 组) 、异氟醚组( I 组) 、乌司他丁预先给药组( S 组) 。

1． 2 方法 参照文献［4］的方法并加以改进，将小鼠置于密闭麻醉箱中，顶盖一小孔与气体监测仪的导管相通，持续监测箱内异氟醚、CO2和 O2的浓度。麻醉箱底部浸于 37℃ 的恒温水浴箱中。I 组和 S 组暴露于1% 异氟醚( 批号: 936245U，Abbott 公司，美国) 3 h，异氟醚以空气( 21% 氧气混合 79% 氮气) 输送，新鲜气体流量 1. 5 L/min，连续 7 d; C 组吸入空气 3 h; S 组于异氟醚暴露前 30 min 腹腔注射乌司他丁 50 000 U/kg。

1． 3 Morris 水迷宫实验和旷场试验（仪器均由上海尊龙凯时人生就是博信息科技有限公司提供） 末次暴露结束后 24 h 进行 Morris 水迷宫实验和旷场试验。在定位航行实验中，记录小鼠游泳速率和潜伏期。在定位航行试验第 4 天完成之后行空间探索试验。此时平台从第Ⅰ象限移除。小鼠从定位航行实验平台放置象限相对的象限即第Ⅲ象限入水，每次进入小鼠游泳 60 s 后停止。记录目标象限穿越次数和目标象限停留时间。

旷场试验持续 3 d。从小鼠放置在中央格时计时，每次记录 15 min。记录中央区停留时间、周边区停留时间、总路程及平均速率。

1． 4 白细胞介素 － 6 ( IL － 6 ) 、白细胞介素 － 1β( IL －1β) 和肿瘤坏死因子 － α( TNF － α) 含量测定 认知功能测试完毕后立即处死小鼠，剥离双侧海马组织，存于－ 80℃ 冰箱，采用 ELISA 法测定海马 IL － 6、IL － 1β 和TNF － α 含量。称重海马，稀释至 400 μL，按试剂盒说明书步骤操作，根据标准品的浓度以及相对应的吸光值( OD450值) 通过 Curve Expert1． 3 软件分析作出标准曲线图，根据酶标仪检测得到样品的，利用标准曲线的方程式计算海马 IL － 6、IL － 1β 和 TNF － α 含量。

1． 5 统计学方法 采用 SPSS 16. 0 统计软件，计量资料组间比较采用成组 t 检验。

3 讨论

探讨围手术期 POCD 发生的原因，以及避免和防范 POCD 成为亟待解决的问题。18 月龄的 C5 /7 小鼠相当于人类中老年期，因此本研究选用 18 月龄鼠作为研究对象，以期了解异氟醚对老年鼠学习记忆的损害。根据 ＲAMMES 的研 究，小 鼠 异 氟 醚 MAC 值 在( 1. 33 ± 0. 16) % ，因此本研究采用 1% 异氟醚浓度 3 h麻醉暴露方案。

Morris 水迷宫是应用于脑学习记忆机制研究的一种实验手段，在学习记忆﹑新药研发﹑海马 /外海马研究﹑药理学﹑毒理学等应用非常普遍。旷场试验是一种经典评价动物行为学的实验模型，主要反映动物在新环境的自主行为和探究行为。本研究中 Morris 水迷宫结果和旷场试验结果提示，I 组老年小鼠的学习记忆能力和空间探索能力均较对照组降低，而 S 组与 C 组差异无统计学意义，说明乌司他丁可减轻异氟醚暴露所致老年小鼠学习探索和记忆能力的损伤。

本研究结果表明，乌司他丁预先给药可改善异氟醚暴露致老年小鼠认知功能障碍，其机制可能与减少海马炎性因子的过度释放有关。神经细胞炎性因子( IL － 1β、TNF － α 和 IL － 6 等) 释放能够导致认知功能减退。炎性因子释放可抑制海马长时程增强，而海马长时程增强是海马学习记忆的关键。另外，IL － 1β能够激活 Caspase － 3，从而导致神经元凋亡，可通过IL － 1β / Caspase － 3 / 神经凋亡途径损害认知功能。而乌司他丁能调节全身炎症反应，抑制促炎性细胞因子的释放、促进**性细胞因子的释放。乌司他丁是从人尿液中分离纯化的广谱蛋白酶抑制剂，可有效抑制多种蛋白酶、糖苷酶、脂水解酶的活性。在脓毒症、休克及心、肺、肝、肠的缺血再灌注损伤中，乌司他丁具有明显的抑制炎症因子释放、保护组织脏器功能的作用。有研究表明在脑缺血再灌注模型的体内外实验中，乌司他丁能够减少脑缺血再灌注损伤。另一项研究证实，在神经病理性疼痛模型中，乌司他丁可抑制 IL － 1β、TNF － α 等炎症因子释放，拮**性因子造成的慢性神经病理性疼痛。本研究结果表明，与对照组比较，I 组海马 IL － 1β 和 TNF － α 含量升高，提示

异氟醚麻醉可促进老年小鼠海马炎性反应，导致其认知功能降低。机制可能与异氟醚导致细胞内钙离子浓度升高，激活 NF － κB 信号转导通路，促进炎性反应有关。而乌司他丁预先给药组促炎性细胞因子IL － 1β、TNF － α 的浓度明显降低，可明显减轻与神经炎性反应相关的神经认知功能损伤。