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穿梭实验对血管性痴呆大鼠认知功能及脑组织血管紧张素含量的影响

摘要目的观察穿梭实验对血管性痴呆大鼠认知功能及脑组织血管紧张素含量的影响并与甲磺酸双氢麦角毒碱作用效果进行比较。

方法实验于 2005- 07 /11 在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所七室完成。选用清洁级 1518 月龄 Wistar 大鼠 48 雌雄不拘,体质量( 200±20) g。按随机摸球法将 48 只大鼠分为 假手术组、模型组、中药组和西药组(阳性对照组), 每组 12 只。除假手术组外进行假手术) , 其余组大鼠均采用改良 Pulsinellis 四血管阻断法建立血管性痴呆模型。中药组:以 0.45 g/( kg·d) 剂量灌胃步长脑心通混悬液由咸阳步长制药有限公司生产,由黄芪、乳香、没药、全蝎、地龙等 16 味中药组成, 0.4 g/西药组以 0.32 mg/( kg·d) 剂量灌胃甲磺酸双氢麦角毒碱混悬液该药由瑞士山德士药厂与天津华津制药厂合作生产生产批号: 970141, 1 mg/假手术组和模型组灌胃同容量生理盐水每天分早、中、晚 次。术后当天开始用药连续周。于造模前造模后 2,4, 8 周进行穿梭箱检查以主动回避反应比率表示大鼠的认知能力。于给药结束后采用放射**分析法测定大鼠大脑皮质、下丘脑、海马血管紧张素、精氨酸加压素含量。对数据进行单因素方差、均数间多重比较 检验数据间相关性处理采用直线相关分析。

结果造模过程中如有动物死亡则补充相应只数*终进入结果分析的大鼠保持为 48 只。主动回避反应比率模型组和中、西药组大鼠术后2, 4, 8 周明显低于假手术组(P < 0.01); 2 个**组均明显高于模型组 (P< 0.01); 

两**组间比较差异不明显(P > 0.05)血管紧张素含量:模型组大鼠大脑皮质、下丘脑和海马明显高于假手术组(P < 0.01), 中、西药组明显低于模型组( P < 0.01) , 两**组间差异不明显 (P > 0.05)精氨酸加压素含量模型组大鼠大脑皮质、下丘脑和海马明显低于假手 术 组 ( P < 0.01) ; 中 、西 药 组 明 显 高 于 模 型 组 ( P < 0.01) ; 中 药 组大脑皮质、下丘脑明显高于西药组( P < 0.05) , 在海马与西药组相近( P > 0.05) 相关性分析结果假手术组、模型组、中药组和西药组大鼠海马血管紧张素含量与主动回避反应比率呈负相关(r=- 0.894, - 0.872,- 0.928, - 0.880, P < 0.05) , 而上述各组大鼠海马精氨酸加压素含量与主动回避反应比率呈显著正相关( r=0.912, 0.892, 0.937, 0.897, P < 0.05) 

结论步长脑心通改善血管性痴呆模型大鼠认知功能的作用可能是通过降低海马等脑组织血管紧张素含量、提高精氨酸加压素含量而实现作用效果与甲磺酸双氢麦角毒碱相当。

主题词痴呆血管性 /中药疗法血管紧张素Ⅱ; 精氨酸升压素认知障碍认知

引言

步长脑心通是以《内经》五脏藏神理论为指导,具有****、化瘀通络、醒脑开窍、宣痹止痛之功效的中成药。本实验旨在观察步长脑心通对血管性痴呆模型大鼠认知功能及大脑皮质、下丘脑和海马血管紧张素、精氨酸加压素含量的影响为血管性痴呆寻求有效**手段探索中药**血管性痴呆的确切药理机制。

材料和方法

设计完全随机分组设计。

单位解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所神经内科。

材料实验于 2005- 07 /11 在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所七室国家重点实验室完成。选用清洁级老龄( 1518 月龄) Wistar 大鼠 48 ,雌雄不拘体质量( 200±20) g, 由解放军第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供 许可证号: SCXK( ) 2003- 0003) 。按随机摸球法将 48 只大鼠分为 4假手术组、模型组、中药组和阳性对照组每组 12 只。每笼 大鼠自由觅食喝水在室温(22±1) ℃、湿度

( 50±5) %环境下喂养。

**和试剂步长脑心通胶囊咸阳步长制药有限公司国药准字 Z20025001, 0.4 g/) , 由黄芪、乳香、没药、全蝎、地龙等 16 味中药组成。以生理盐水制成混悬液。喜得镇瑞士山德士药厂与天津华津制药厂合作生产批准文号: (91)卫药准字 X- 156 , 1 mg/生产批号: 970141) , 

用生理盐水配成混悬液。血管紧张素、精氨酸加压素放射**分析法药盒分别购自中国同位素公司北方试剂研究所和解放军**军医大学神经生物学教研室。

设计、实施、评估者实验设计为**作者干预实施为全部作者主动回避反应和脑组织血管紧张素、精氨酸加压素含量检测为另二工作人员检测者不知晓动物分组情况均受过专业培训。


方法:

改良 Pulsinellis 四血管阻断法制作血管性痴呆模型除假手术组外其余大鼠用 10 g/L 的****钠腹腔注射麻醉大鼠取颈前部正中切口钝性分离双侧颈总动脉穿 号线备用缝合颈部皮肤。然后取颈背部正中切口沿**颈椎翼小孔烧灼双侧椎动脉,阻断血供 24 h 再以微动脉夹反复夹闭双侧颈总动脉, 5 min /间隔 1 h, 共 次。假手术组除不烧灼双侧椎动脉不夹闭双侧颈总动脉外其余处理同前。

给**法中药组参照文献以 0.45 g/( kg·d)剂量灌胃步长脑心通混悬液西药组以 0.32 mg/(kg·d)剂量灌胃甲磺酸双氢麦角毒碱混悬液假手术组和模型组灌胃同容量生理盐水分早、中、晚 次。术后当天开始用药连续周。

穿梭箱检查采用上海尊龙凯时人生就是博信息科技有限公司提供的穿梭箱主动回避反应系统。该系统以声、光为条件刺激。如大鼠在条件刺激后即能完成穿梭动作称主动回避反应。大鼠的认知功能以完成主动回避反应的次数与测试总次数(20 

)的比值即主动回避反应比率表示。术前大鼠行 7 d 的穿梭箱训练以主动回避反应比率≥ 80%入选, < 80%

者淘汰;于术前术后 2, 4, 8 周行穿梭箱检查。

标本采集、处理及储存大鼠于给药结束后在无麻醉下快速断头、取全脑置沸生理盐水中煮 5 min 取出用滤纸吸干附着的液体后分离大脑皮质、下丘脑和海马分别称重后加入 1 mol /L HCl 1 m L, 匀浆后倒入塑料指形管中室温放置 100 min, 再加入 1 mol /LNa OH 1 m L, 4 

℃, 4 000 r /min, 离心 10 min, 取上清液- 70 ℃ 冰箱保存待测。

指标测定采用放射**分析法 测定血管紧张素、精氨酸加压素含量。操作严格按药盒说明书进行,并根据标准曲线求得标本实际浓度。

主要观察指标: ①造模前后各组大鼠主动回避反应比率差异。给药结束后各组大鼠不同脑区血管紧张素、精氨酸加压素含量比较。给药结束后各组大鼠海马血管紧张素、精氨酸加压素含量与主动回避反应的相关性。

统计学分析计量结果采用 x±s 表示由**作者采用 SPSS 10.0 软件对数据进行单因素方差、均数间多重比较检验数据间相关性处理采用直线相关分析。

结果

2.1 实验动物数量分析 纳入大鼠 48 造模过程中如有动物死亡则补充相应只数*终进入结果分析的大鼠保持为 48 只。

2.2 各组大鼠穿梭箱检查结果 见表 1

2.3 给药结束后各组大鼠大脑皮质、下丘脑和海马血管紧张素含量比较 见表 2

2.4 给药结束后各组大鼠大脑皮质、下丘脑和海马精氨酸加压素含量比较 见表 3 

2.5 各组大鼠海马血管紧张素、精氨酸加压素含量与主动回避反应的相关性分析 假手术组、模型组、中药组和西药组大鼠海马血管紧张素含量与主动回避反应比率呈负相关( r=- 0.894, - 0.872, - 0.928,- 0.880, P < 0.05) , 而各组精氨酸加压素含量与主动回避 反 应 比 率 呈 显 著 正 相 关 ( r =0.912, 0.892, 0.937,

0.897, P < 0.05) 

讨论

血管性痴呆是由于反复脑缺血导致与认知活动相关的海马、皮质等结构不可逆的损害。从中医辨证的角度来看系肾精亏虚、髓海失充、肝郁脾虚、痰阻血瘀、心脾亏损复因情志失调、劳作失度或他病累及而引发肝风风挟痰瘀血苑于上发为本病其中肾虚血瘀是关键。步长脑心通由黄芪、乳香、没药、全蝎、地龙等16 味中药组成立法方义就是****、化瘀通络且能扶正固本、攻补兼施、标本同治使瘀散血**畅心脑脉络得以濡养可列为**血管性痴呆优选中成药。

本实验采用电脑控制的穿梭箱系统对各组大鼠进行行为学测试发现模型组大鼠造模后 2, 4, 8 周主动回避反应比率均明显低于假手术组(P < 0.01); 中、西药组虽明显低于假手术组 P < 0.01), 但均明显高于模型组(P < 0.01); 

两**组间则无明显差异(P > 0.05)。表明慢性脑灌注不足可引起大鼠认知功能损害而步长脑心通与西药甲磺酸双氢麦角毒碱疗效相当对脑组织细胞起到修复营养作用并显著改善血管性痴呆大鼠认知功能。

血管紧张素和精氨酸加压素是具有生物活性的多肽不仅在血液中起着类似循环**的作用而且在**神经系统中发挥着神经递质的作用参与脑的**神经功能与学习记忆密切相关。海马及其周围皮质是外显记忆神经通路的重要组成部分。因此,在探讨血管性痴呆发病机制、干预**、**筛选及评价中检测不同脑区血管紧张素和精氨酸加压素的含量变化近年来日益受到人们的关注。

除肾素血管紧张素系统外脑内存在局部肾素-血管紧张素系统。血管紧张素是脑内肾素血管紧张素系统的主要效应物质在下丘脑含量*高大脑皮质、边缘系统含量也相当丰富。长时程增强是学习、记忆储存的功能单位在海马齿状回 CA1 到 CA3 区均有习得性长时程增强的突触应。Wayner 等发现将血管紧张素直接注入海马背侧可抑制长时程增强的产生如提前注入选择性血管紧张素受体亚型 1的拮抗剂则可阻断此反应。近年来又证实脑室注入血管紧张素或其受体激动剂可易化长时程增强显著改善大鼠记忆的获取、保留和再现。

本实验结果表明模型组大鼠大脑皮质、下丘脑和海马血管紧张含量显著高于假手术组(P < 0.01), 中、西药组较模型组则有明显下调趋势( P < 0.01) 。揭示在血管性痴呆的发病中脑缺血、缺氧可能干扰了**肾素血管紧张素系统引起某些核团神经元及其交感神经活动增强导致脑内血管紧张素含量持续显著升高,进而影响了认知功能同时表明步长脑心通与西药组一样可通过改善脑血液循环、保护脑组织使受损的神经元得以修复从而调节血管紧张素的分解、合成与释放对血管性痴呆有显著的改善作用。

大脑的边缘系统尤其是海马在信息整合、储存和传导过程中起着至关重要的作用对维持机体正常的学习记忆是不可缺少的。近年研究发现海马 CA1区神经细胞的凋亡与丢失是血管性痴呆形成的病理学基础。本实验中慢性脑缺血、中西药**使脑组织不同区域血管紧张素、精氨酸加压素含量明显降低或增多大鼠主动回避反应比率也出现相应显著性改变其中海马内神经递质变化与主动回避反应比率尤 为 密 切 呈 显 著 直 线 正 或 负 相 关 揭示海马的这些神经肽代谢对维持或改善学习记忆功能更为关键充分体现海马在学习记忆功能方面的重要生物学意义。总之步长脑心通**血管性痴呆的机制可能是通过降低海马等脑组织血管紧张素含量、提高精氨酸加压素含量而实现但其确切机制有待进一步深入研究。