脾虚对大鼠学习记忆影响的研究
材料与方法
1． 实验动物：
选取清洁级12周龄Wistar大鼠80只，雌雄各半，体重180±20g，由中山医科大学实验动物中心提供，合格证（检证字）2001A038号，（中山医动字）2002053号。动物饲养于福建中医学院实验动物中心，医学实验动物环境设施合格证书医动字第23-016号，动物分笼饲养，自由饮水，饲料由福建中医学院实验动物中心提供标准颗粒饲料。
2． 实验药品：
实验所需中药材向福建省药材公司购买道地药材，实验所需试剂双缩脲蛋白定量测试盒、NO测试盒、NOS测试盒及一些配用试剂由福建中医学院中心实验室向南京建成生物研究所代为购买或提供，试剂盒批号20021010。
3． **配制：
（1）造模** 小承气汤由厚朴、枳实、大黄组成。质量比按3：3：2配备，先经蒸馏水浸泡2h，按常法煎煮2次，每次煮沸后煎煮20min过滤，合并滤液，70-80℃水浴浓缩为2g/ml药液，冰箱储存备用。
（2）**** 四君子汤由人参、白术、茯苓、炙甘草组成。质量比按2：2：2：1配备，先经蒸馏水浸泡2h，按常法煎煮2次，每次40min过滤，合并滤液，70-80℃水浴浓缩为2g/ml药液，冰箱储存备用。
以上实验用汤剂由福建中医学院屏山制药厂加工制成所需制剂。
4． 仪器设备：
RF—540荧光分光光度计 上海
721分光光度计 上海
BACMON高速冷冻离心机 中国
恒温水浴箱 中国
SAYAN超低温冰箱 日本
上海尊龙凯时人生就是博信息科技有限公司提供上等的morris水迷宫视频分析系统。
5． 造模方法：
参照傅湘琦等依据中医耗气破气和饮食失节的理论塑造大鼠脾虚模型的方法[43]，稍加以改进。造模组隔日给药，上、下午各一次，每次2毫升，给药后**日禁食，自由饮水，造模时间为6周。
6． 分组与施加因素：
（1）分组 动物适养三天后，大鼠随机分成2大组，正常组A组、模型组B组，正常组20只，模型组60只，正常组又分为A1、A2 2小组，分别用来与生化测定各组和行为测定各组进行比较；模型组分为脾虚组B1、C1、脾虚**组B2、C2和脾虚自由恢复组B3、C3 6小组，每小组各10只，雌雄各半。其中A1、B1、B2、B3 4组用来测定生化指标，A2、C1、C2、C3 4组用来测定行为学指标。
（2）施加因素 首先对模型组B组造模，造模时A组予等量生理盐水。造模成功后， A1、B1进行各项生化指标测定， A2、C1进行水迷宫实验；B2、C2组灌服四君子汤，每天上、下午各1次，每次2ml，连续10天， B3 、C3予等量生理盐水，大鼠服药剂量按《中药药理研究方法学》[44]所提供的“实验动物与人按体表面积等效剂量换算比率表”倍数折算。10天后B2、B3进行各项生化指标测定，C2、C3进行水迷宫实验。
7． 标本的采集与制备：
大鼠给药结束后，断头处死，快速取脑，称湿重，于冰盘上迅速剥离表面浆膜及血管，取左侧大脑皮层固定部位1.0×1.0cm组织，称重,以冷生理盐水作匀浆介质，研磨制成10%的脑匀浆液，离心取清，冰箱储存待测。
8． 生化指标的观测及方法：
（1）标本蛋白含量测定 采用双缩脲法测定标本蛋白定量，凡分子中含有两个氨基甲酰基（-CONH2）的化合物能与碱性酮溶液作用，形成紫色复合物，称为双缩脲反应，蛋白分子中有许多肽键（-CONH-）都能起此反应，各种蛋白显色程度基本相同。具体操作参照试剂盒说明书。
（2）脑组织NO含量测定 应用改良的Griess法[45]，通过测定NO代谢产物亚硝酸盐(NO2-)和硝酸盐(NO3-)的浓度作为衡量NO含量的指标。具体操作参照NO试剂盒说明书。
（3）脑组织NOS活性测定 在有氧和辅助因子的情况下，NOS催化L-精氨酸生成L-狐氨酸和NO。由于氧合血红蛋白可与NO迅速而不可逆地生成高铁血红蛋白(mG)。因而，通过分光光度法(双波长法)检测形成的mG，可反映由NOS催化生成的NO量，从而间接测定NOS的活性。具体操作参照NOS试剂盒说明书，分别测出总的NOS和cNOS、iNOS活性。
以上各项生化指标的测试均由专业人员进行测试，测定结果均以换算后的测定值与其相应蛋白含量的比值表示。
9． Morris水迷宫实验 脾虚对大鼠学习记忆影响的实验研究
（1） 定位航行试验(place navigation) 试验开始先将大鼠放入水池中(不放平台)自由游泳2分钟，使其熟悉迷宫环境。试验共历时5天，每天定于固定时间段(blocks)，每个时间段训练4次。训练开始时，将平台置于NW象限，从池壁四个起始点的任一点将大鼠面向池壁放入水池。自由录像记录系统记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)和游泳路径，4次训练即将大鼠分别从四个不同的起始点（不同象限）放入水中。大鼠找到平台后或120秒内找不到平台(潜伏期记为120秒)，则由实验者将其拿上平台，在平台上休息15秒，再进行下一次试验。每日以大鼠四次训练潜伏期的平均值做为大鼠当日的学习成绩。
（2） 空间探索试验(spatial probe) 第6天撤除原平台，将大鼠任选1个入水点放入水中，所有大鼠必须为同一入水点，记录大鼠在2min内跨越原平台的次数。
10．统计学处理：
结果均采用SPSS10.0统计软件分析，所用数据用平均数±标准差（x1±s）表示，各组间比较用t检验。
实验结果
1． 各组造模及给药前后一般情况观察
正常对照组及其余各组造模前动物精神好，动作灵活，毛发白而有光泽，皮肤粘膜红润，饮食量、饮水量多，体重呈直线上升；造模后模型各组动物精神萎糜，乏力、倦怠、闭目、喜扎堆、纳食减少，体重逐渐下降或持平，皮毛疏松、粗糙无光泽，且颜色发黄、易脱落、足蹼、鼻尖、耳缘粘膜出现苍白，**周围充血、湿润，造模一周后出现稀便，三周后个别动物因极度衰弱死亡（C3组死亡1只）。**组动物随着中药**，饮食逐渐恢复，动物功能低下的表现逐渐改善，皮毛变得舒展，粘膜逐渐红润、体重也逐渐增加，至给药结束时基本恢复正常，与正常对照组比较无明显异常；自然恢复组动物停止造模条件后，—般表现均不同程度改善，但较中药**组恢复明显缓慢。脾虚对大鼠学习记忆影响的实验研究
2.正常组与脾虚组大鼠脑组织中NO含量和NOS活性比较
表1：正常组与脾虚组大鼠脑组织中NO含量和NOS活性比较（x1±s）
组别 n NO NOS（U/mgprot）
（μmol/gprot） 总NOS cNOS iNOS
正常组A1 10 1.91±0.53 146.06±41.90 115.96±41.56 30.10±3.55
脾虚组B1 10 0.99±0.431） 62.95±21.771） 45.72±23.031） 17.23±5.631）
注：与正常组比较，1）P<0.01
表2：大鼠脑组织中NO含量和NOS活性比较（x1±s）
组别 n NO NOS（U/mgprot）
（μmol/gprot） 总NOS cNOS iNOS
脾虚组**组B2 10 1.80±0.30 121.43±27.79 94.33±28.47 27.10±5.93
脾虚组自由恢复组B3 10 1.25±0.292） 81.05±21.182） 62.70±17.312） 18.35±4.681）
注：与**组比较，1）P<0.05、1）P<0.01
从表中可看出：正常组与脾虚组比较，脾虚组NO含量、NOS活性明显较正常组低，差异显著 (P<0.01) ，见表1；脾虚**组与脾虚自由恢复组比较，脾虚自由恢复组NO含量、NOS活性明显较正常组低，差异显著 (P<0.01) ，见表2。
3.各组大鼠水迷宫实验结果
实验中正常组与脾虚组比较，正常组大鼠在MWM中定位平台的学习获得过程较快，脾虚组寻找平台的潜伏期明显延长，学习获得比较慢，有的大鼠甚至到训练结束还未学会寻找平台，二组之间差异显著。统计结果见表3；脾虚**组与脾虚自由恢复组比较，脾虚**组在MWM中定位平台的学习获得过程较快，脾虚自由恢复组学习获得较慢，二组之间差异显著，统计结果见表4。脾虚对大鼠学习记忆影响的实验研究
表3 正常组与脾虚组大鼠潜伏期变化及跨台次数比较（x1±s）
组别 n 潜伏期（s） 跨台次数（次）
**天 **天 第三天 第四天 第五天
正常组A2 10 48.99±19.24 35.42±9.501) 21.07±12.321) 20.50±12.371) 14.24±4.101) 7.50±2.551)
脾虚组C1 10 53.24±19.23 49.48±12.87 45.28±10.51 38.92±8.07 35.93±7.57 4.30±1.25
注：与正常组比较，1）P<0.01
表4 脾虚**组与脾虚自由恢复组大鼠潜伏期变化及跨台次数比较（x1±s）
组别 n 潜伏期（s） 跨台次数（次）
**天 **天 第三天 第四天 第五天
脾虚**组C2 10 59.88±20.23 39.36±14.63 27.71±8.86 18.61±12.35 15.89±9.63 7.20±1.99
脾虚自由恢复组C3 9 47.20±20.69 40.88±14.08 38.22±10.201) 35.98±9.082) 31.48±7.292) 5.10±1.791)
注：与脾虚**组比较， 1）P<0.05、2）P<0.01
在定位航行试验中，4组大鼠在历时5d的水迷宫训练中，潜伏期结果的动态变化见图1。各组大鼠在训练第1天中，绝大多数不能在规定的120s内找到平台，不少大鼠穿过了平台但不知停留或站立。从第2天开始陆续有大鼠能自由寻找到平台逃避，随着训练天数增加，逃避潜伏期不断缩短，统计学分析除正常组与脾虚组有差异外，其余各组大鼠的逃避潜伏期差异无显著性(P>0.05)。从第3天起各组大鼠潜伏期拉开距离，4组大鼠找到平台所需时间分别为45s、38s、28s和21s，脾虚组与正常对照组、脾虚自由恢复组与脾虚**组差异显著(P<0.01)。在后两天的训练中各组大鼠成绩逐渐趋于稳定。脾虚组有部分大鼠直到训练结束还未学会寻找平台。
脾虚对大鼠学习记忆影响的实验研究