中药益肾平肝方对脱髓鞘模型小鼠社会交互行为的影响及作用靶点
【摘要】 目的 观察中药益肾平肝方对精神分裂症的zhi疗效果以及探究其作用的潜在靶标。方法 实验动物采用成年雄性
C57BL/6 小鼠，6 周龄，实验分为 3 组，每组 10 只: 对照组，cuprizone( CPZ) 模型组和益肾平肝方( Yishenpingganfang，YSPGF) zhi疗组，实验共进行 6 周。社会交互实验以及组织采集在后一次给予中药zhi疗 24h 后进行。采用社会交互实验以评价 YSPGF 对小鼠精神分裂症样行为的影响; 采用髓鞘特异性免yi组化和 Western blotting 观察成熟少突胶质细胞及少突胶质细胞前体细胞的表达变化。结果 CPZ 模型组小鼠于第 3 周出现明显体质量下降( P ＜ 0. 05) ，YSPGF zhi疗组与 CPZ 模型组相比，体质量差异无统计学意义( P ＞ 0. 05) ; 社会交互实验: Trial 1 实验中: 对照组小鼠围绕陌生小鼠 1 ( Stranger 1) 的时间明显大于围绕空杯子( Empty) 的时间( P ＜ 0. 001) 。YSPGF 组与对照组类似，围绕 Stranger 1 与 Empty 的时间差异有统计学意义( P ＜ 0. 01) 。但模型组小鼠围绕 Stranger 1 与 Empty 的时间之间差异无统计学意义( P ＞ 0. 05) 。Trial 2 实验中: 对照组小鼠对新加入的 Stranger 2 较之已经熟悉的 Stranger 1 更加感兴趣( P ＜ 0. 001) 第; 成熟少突胶质细胞特异性抗体髓鞘碱性蛋白 ( myelin basic protein，MBP) 免yi组织化学染色和 Western blotting 显示: CPZ 模型组小鼠成熟胶质细胞/髓鞘在胼胝体有一定程度缺失，YSPGF 组与 CPZ 模型组相比，髓鞘脱失有所好转。进一步实验显示: 少突胶质细胞前体细胞血小板源生长因子受体 α( platelet-derived growth factor receptoralpha，PDGFＲ-α) 在 CPZ 诱导脱髓鞘后有反应性增生。结论 中药 YSPGF 可以改善 CPZ 诱导小鼠的社会退缩，改善少突胶质细胞/髓鞘结构的损害。
【关键词】 精神分裂症; 益肾平肝方; 少突胶质细胞; 双环己酮草酰二腙; 社会交互
精神分裂症是一种病因尚未完全阐明的复杂性的精神ji病，全球人口受累率达到 0. 5% ～ 1. 0%［1］，是导致残疾的十种主要ji病之一，给家庭和社会带来巨大的经济负担［2］。精神分裂症发病有多种假说，包括多巴胺 D2 受体亢进假说及神经发育异常假说［3］。目前抗精神病**主要是基于多巴胺 D2 受体作为靶点发挥临床zhi疗效果，但是仍然有一部分患者无法临床痊愈，因此从神经保护角度开发新的抗精神病**是精神**研究的重要方向之一［4］。益肾平肝方( Yishenpingganfang，YSPGF) ［5］ 是首都医科大学附属北京安定医院中西医结合团队用于zhi疗精神分裂症前驱期的一个有效经验方，其临床研究结果表明，该中**剂对精神分裂症前驱期的症状和认知损害有改善作用。它的主要成分有菊花、山茱萸、防风、何首乌等。从山茱萸［6］和何首乌［7］中提取的活性成分对神经有保护作用。cuprizone 模型［8］( CPZ 模型) 是基于神经发育假说的一种能够诱导中qu神经系统少突胶质细胞丢失和脱髓鞘的精神分裂症样模型［9］。为此，本研究采用 CPZ 模型研究中药益肾平肝方的药理学作用机制［10］。
1 材料与方法
1. 1 实验动物
6 周龄的雄性 C57BL /6 小鼠，共 30 只，体质量( 20 ± 2) g。所有小鼠均由首都医科大学实验动物部提供，实验动物许可证号: SCXK( 京) 2016 － 0011。实验环境清洁，昼夜交替 12 h，正常饮食饲养 1 周以适应环境。本实验通过首都医科大学动物伦理委员会批准( 伦理批号: AEEI-2018 － 047) 。
1. 2 主要药品及试剂
双环己酮草酰二腙( cuprizone，CPZ) 和成熟少突胶质细胞特异性抗体髓鞘碱性蛋白抗体 ( Anti-MyelinBasic Protein，MBP 抗体) 购自美国 Sigma 公司; 少突胶质细胞前体细胞血小板源生长因子受体 α( plateletderived growth factor receptor-alpha，PDGFＲ-α) 抗体( PDGFＲ-α 抗 体，APA5 ) 购 自 美 国 Abcam 公 司。YSPGF 的各种单药饮片购自北京同仁堂 ( 大栅栏店) ，在首都医科大学宣武医院熬制成浸膏。兔二步法检测试剂盒和 DAB 显示试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1. 3 主要仪器
社会交互实验系统( 40 cm × 60 cm × 20 cm，由3 个连在一起的箱子构成，厢壁由透明有机玻璃制成) 购自上海尊龙凯时人生就是博信息科技有限公司。
2 结果
2. 1 YSPGF 对小鼠体质量及小鼠胼胝体髓鞘碱性蛋白( myelin basic protein，MBP) 表达的影响前 2 周，3 组小鼠体质量变化差异无统计学意义。但从第 3 周开始，模型组小鼠体质量明显减低( P ＜0. 05) 。第 4 周体质量略微增加。模型组小鼠体质量变化与 YSPGF 组小鼠相比，差异无统计学意义( P ＞0. 05) ( 图 1A) 。免yi组化分析结果( 图 1B) 显示，模型组小鼠胼胝体 MBP 表达明显下降，说明本研究CPZ 模型的建立是成功的。给予 YSPGF 处理后该组小鼠 MBP 表达有一定提高，提示 YSPGF 对白质损伤具有保护作用。
2. 2 YSPGF 对 CPZ 小鼠社会交互的影响
Trial 1 实 验 中: 对 照 组 小 鼠 围 绕 陌 生 小 鼠 1( Stranger 1) 的时间明显大于围绕空杯子( Empty)的时间( P ＜ 0. 001 ) 。YSPGF 组与对照组类似，围绕 Stranger 1 与 Empty 的时间差异有统计学意义( P ＜ 0. 01 ) 。但 模 型 组 小 鼠 围 绕 Stranger 1 与Empty 的时间之间差异无统计学意义( P ＞ 0. 05 )( 图 2A) 。Trial 2 实验中: 对照组小鼠对新加入的 Stranger 2 较之已经熟悉的 Stranger 1 更加感兴趣( P ＜0. 001) ，与 对 照 组 不 同，模 型 组 小 鼠 并 没 有 对Stranger 2 表现出好奇，表明其社会动力以及对新奇事物的探索能力下降; YSPGF 组小鼠与新的陌生小鼠 接 触 时 间 与 模 型 组 相 比，明 显 增 多，表 明YSPGF 对 CPZ 小鼠的社会交往能力以及对新生事物的探索能力均有改善( 图 2B) 。
2. 3 YSPGF 对小鼠海马 PDGFＲ-α 表达的影响
Western blotting 结果( 图3) 显示，PDGFＲ-α 经 CPZ诱导脱髓鞘后有反应性增生，给予 YSPGF 进行干预后，PDGFＲ-α 的代偿性增生与模型组相比，呈减少趋势，表明 YSPGF 对小鼠的少突胶质细胞损害有所改善。
3 讨论
越来越多的证据［11-13］显示，精神分裂症中少突胶质细胞/髓鞘存在异常，其证据主要来源于影像学研究［11］、尸检［12］以及基因学研究［13］。CPZ［14］是一种铜离子的螯合剂，第yi次对 CPZ 的描述可追溯到 1950年 Gustav Nilsson 的实验［15-16］。研究［17］显示: CPZ 选择性损伤少突胶质细胞。给予不同时间的 CPZ 处理会诱导出不同的行为学改变。例如，给予小鼠 2 ～ 3周 CPZ 处理，小鼠会出现更多的攀爬行为，如果给予4 ～ 6 周 CPZ，则表现为社会功能退缩。本实验中，在给予小鼠 4 周 CPZ 后，免yi组化结果显示，CPZ 小鼠在 4 周后少突胶质细胞大面积凋亡，说明笔者的 CPZ小鼠模型是成功的。在本实验中，笔者采用 CPZ 诱导精神分裂症样动物行为，采用中药 YSPGF 对 CPZ 小鼠进行zhi疗。本研究社会交互实验结果显示; 第yi轮实验( Trial 1)中，对照组小鼠围绕陌生小鼠 1 ( Stranger 1) 的时间明显大于围绕空杯子( Empty) 的时间，YSPGF 组与对照组类似，围绕 Stranger 1 与 Empty 的时间差异有统计学意义，但模型组小鼠围绕 Stranger 1 与 Empty 的时间之间差异无统计学意义，**轮实验 ( Trial 2) 中，对照组小鼠对新加入的 Stranger 2 较之已经熟悉的Stranger 1 更加感兴趣，与对照组不同，模型组小鼠并没有对 Stranger 2 表现出好奇，表明其社会动力以及对新奇事物的探索能力下降; YSPGF 组社会互动行为较模型组有一定的改善; 社会交互实验主要反映实验动物的社会交往能力和对新事物的探索能力，在一定程度上模拟了精神分裂症的阴性症状( 意志行为活动缺乏和情感平淡) ，实验结果表明，给予 YSPGF 进行干预，CPZ 小鼠的社会交往能力和探索能力有所改善，提示 YSPGF 对精神分裂症的阴性症状有一定的改善作用。本研究免yi组化结果显示，模型组小鼠胼胝体MBP 表达明显下降，Western blotting 结果显示，少突胶质细胞前体细胞 PDGFＲ-α 在 CPZ 诱导脱髓鞘后有反应性增生，说明经 CPZ 处理后小鼠少突胶质细胞/髓鞘有一定程度的受损。而经 YSPGF 干预后，MBP表达增多和 PDGFＲ-α 减少，说明中**剂对少突胶质细胞/髓鞘的受损有一定改善作用，也提示了该chu方有一定神经保护作用，也部分解释了 YSPGF 改善CPZ 小鼠社会交互受损的药理学机制。YSPGF 中的山茱萸、何首乌含有神经保护作用的成分。多项研究［18-19］表明山茱萸中的山茱萸环烯醚萜苷［6］( cornel iridoid glycoside，CIG) 能改善局灶性脑缺血大鼠模型的神经功能缺损，抑制脑组织炎性反应和神经元凋亡，促进神经发生和血管新生; 并且可改善穹窿 － 海马伞切断模型大鼠学习记忆功能，增高脑组织神经营养因子含量和神经元存活［20］。何首乌中提取的主要活性成分———四羟芪葡萄糖苷 ( tetrahydroxystilbene glucoside，TSG) 具有明显的神经保护作用，可以改善动物的记忆能力。这些研究结果间接支持了本研究所发现的 YSPGF 的神经保护作用。本研究只是用社会交互行为模型探讨了 YSPGF对精神分裂症的阴性症状的改善作用，今后应该增加其他行为模型观察该方对精神分裂症的多维zhi疗效果，如用 Y 迷宫观察该方对 CPZ 小鼠的工作记忆受损是否有改善作用，用 PPI 观察该方对 CPZ 小鼠的感觉门控受损是否有改善作用。本研究只是从 MBP 和PDGFＲ-α 的表达探讨了 YSPGF 的神经保护机制，今后应该从 NＲG1-ErBb4 信号通路以及氧化应激通路更进一步探讨该方的神经保护作用。本研究只是用小样本动物进行了单一行为学实验，今后应该根据行为学的增多和作用机制的深度探讨扩大样本量。
