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Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力

阿尔茨海默病Alzheimers diseaseAD)是与 年龄相关的zhong枢神经系统退行性**以进行性记 忆下降及认知损伤为特点[1]由于人口老龄化目前 世界范围内AD患病人数已经达到4 400[2]给社 会带来沉重负担AD的病因和发病机制复杂且并 不完全清楚现在的zhi疗yao物不能完全满足临床需 要并且费用昂贵还存在肝毒性腹泻恶心呕吐、 头晕等不佳反应[3]因此研究疗效更确切副作用 更少的AD zhi疗yao物非常紧迫近年来大量文献研 究报道AD与氧化应激联系紧密改善氧化应激可 以明显改善AD[4-6]。bu肾填髓方是根据中医学理论 肾虚髓亏”,基于经典方剂孔圣枕中丹(《千金方) 化裁而成相关研究证实bu肾填髓方药能有效延缓 痴呆早期患者大脑结构的萎缩改善其认知及记忆 功能'但其作用机制并不十分明确本研究拟以 AD模型大鼠为实验对象从线粒体的氧化应激角 度探讨bu肾填髓方抗AD的作用机制

1材料与仪器

1.1实验动物

90只健康雄性清洁级SD大鼠体质量(180±20)g, 购自斯莱克景达实验动物有限公司许可证号:SYXK (2010-0013;实验动物来源证号430047000饲 养于湖南省人民医院动物实验室所有动物饲养在 室温22~25湿度40%~60%条件下以普通饲料 喂养自由进食饮水将大鼠观察性饲养1周后进行 Y迷宫实验初筛

1.2实验yao物试剂及仪器设备

bu肾填髓方由石菖蒲10 g远志10 g何首乌 15 gyin羊藿15 g龟板20 g龙骨20 g组成盐酸 多奈哌齐片卫材药业有限公司批号1611013。 ApW2Sigma 公司批号A4559A^42-1Sigma 公司

批号:A2201(以无菌双蒸水将ApM2AP42-1配制成 浓度为2 pg/pL,置于37 t恒温箱孵育7 d保存于 4 °C 冰箱备用)。丙二醒(malondialdehyde,MDA)试剂 盒南京建成批号A003-1超氧化物歧化酶(su-peroxide dismufaseSOD)试剂盒 武 汉华美 批号 : P03037347大鼠脑立体定位仪美国K0PF(Model900)。Morris水迷宫上海尊龙凯时人生就是博(XR-XM101)Y迷宫上海尊龙凯时人生就是博(XR-XY1032)透射式电子显微镜美国 FEI 公司(Tecnai G2 Spirit)。

2方法

2.1 AD大鼠模型的复制及干预

根据参考文献[8]Y型迷宫初筛剔除先天愚 钝的大鼠随后依据旷场实验水平运动得分将大鼠 分为正常组假手术组模型组西药组中药组每 组10只参照Xi[9]方法复制AD模型除正常组 夕卜,各组大鼠以10%水合氯醛350 mg/kg)腹腔注射 麻醉后俯卧固定于脑立体定位仪常规备皮**头 顶正中切开皮肤找到大鼠前囟结合大鼠脑立体 定向仪图谱[10]及预实验结果在大鼠两侧侧脑室(位 置前囟后1 mm矢状缝向左右侧劳开1.5 mm, 4.6 mm)用针头钻开颅骨假手术组两侧侧脑室 注入AP42-1 5 pL其余实验组缓慢注入ApM2 5 pL。 注入时间均为5 min留针时间5 min注射完毕后 缝合皮肤局部红霉素外涂防感染

正常组不灌胃其他组造模后隔天开始灌胃根 据人与大鼠换算系数0.018,以大鼠体质量200 g成 人体质量60 kg为参考西药组按0.33 mg/(kgd)、中 药组按生药量8.1 g/(kgd)的剂量灌胃给予药液 8 mL/(kgd)。模型组和假手术组灌服等容量生理盐 水连续给药4

造模成功标准[8]:造模结束后第15,对大鼠再次进行Y型迷宫筛选15次测试中正确次数 比造模前下降1/3者为造模成功共剔除死亡大鼠 5造模失败3将存活的成功模型纳人下一步 实验其中假手术组8模型组7中药组9, 西药组8正常组10成模率80%并遵循随 机原则补齐每组动物为10

  • Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力

在各组大鼠28 d干预完成后每天下午14:30 左右开始定位航行训练连续d每天将大鼠面向 池壁分别从4个平均分布的标记点轻轻放人水中, 记录min内其找到水下平台所花费的时间逃 避潜伏期escape latency)。6天移除隐藏的平 台从定位航行实验的第1个人水点将大鼠放人水 池记录min内大鼠经过虚拟平台的总次数原平 台象限的活动时间与距离占总游泳时间及总游程 的百分比[11]

  • ELISATBA法分别测定前额皮质组织匀浆及血 清中SODMDA活性

水迷宫测试结束后大鼠用10%水合氯醛 (350 mg/kg)麻醉腹主动脉采血后断头取脑碎冰上 迅速分离出大鼠前额皮质预冷的生理盐水洗净血zi, 吸干水分后称质量制备成10%组织匀浆液分别低 温离心机3 500 r/min离心匀浆液及血液15 min取 上清按照SODMDA试剂盒说明书操作测定

2.4电镜观察

大鼠麻醉处死后断头取脑碎冰上分离大鼠海 马2.5%戊二醛固定h以上0.1 mmol/L磷酸 缓冲液清洗31%锇酸固定1~2h0.1 mmol/L 磷酸缓冲液漂洗3常规50%70%90%100% 丙酮脱水经过浸泡包埋固化后超薄切片机切片, 柠檬酸铅和醋酸铀双染透射电镜下放大20 000

观察并拍照记录

2.5统计方法

SPSS l7.0软件进行统计分析实验数据均 用x±s表示水迷宫逃避潜伏期采用重复测量方差 分析[12]其余各组间比较使用单因素方差分析组间 两两比较使用LSD检验P<0.05表示差异有统计学 意义

3结果

3.1 水迷宫定位航行试验

随着训练时间的延长各组大鼠逃避潜伏期逐 渐缩短与假手术组比较模型组第3天开始出现逃 避潜伏期延长P<0.01);与模型组比较中药组西 药组逃避潜伏期第3天开始缩短(P<0.01 )。与西药组 相比中药组逃避潜伏期稍有延长但差异无统计学 意义(P>0.05)。

3.2水迷宫空间探索试验

与假手术组相比模型组大鼠原平台象限游泳时 间百分比及游泳距离百分降低差异有统计学意义 P<0.01);与模型组相比中药组西药组游泳时间

及游泳距离的百分比升高(P<0.05P<0.01);与西 药组相比中药组原平台象限游泳时间所占百分比 稍有降低但两者差异无统计学意义(P>0.05),中药 组原平台象限游泳距离所占百分比降低两者差异 有统计学意义(P<0.01)。

3.3bu肾填髓方对大鼠前额皮质组织及血清SOD、 MDA酶活性的影响

与假手术组比较模型组SOD活性明显下降MDA 活性显著升高(P<0.01);与模型组比较中药组西 药组SOD活性均升高MDA活性均显著下降(P<0.05P<0.01);西药组与中药组SOD活性MDA活性比 较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3

3.4bu肾填髓方对大鼠海马线粒体的影响

电镜结果显示正常组和假手术组线粒体形态 清楚完整大小形状规则分布均匀且数目多外膜 平整光滑线粒体膜间隙无明显扩张线粒体嵴排列 整齐呈板层状内膜和嵴内腔含有较多均匀的颗粒 状基质未见线粒体水肿及空泡化改变

模型组部分线粒体形态欠完整结构不清晰体 积缩小大小形状不规则分布紊乱且数目减少线 粒体外膜模糊内嵴大量断裂或溶解消失线粒体肿 胀基质疏松清淡未见基质颗粒出现空泡化改变。 中药组西药组大鼠线粒体组织结构上较为完整清 晰大小形状相对规则数目较模型组增多外膜可 见尚光滑内嵴增多排列比较整齐偶可见嵴内腔 稍有扩大内嵴溶解减轻部分线粒体肿胀明显改 善基质较均匀可见少许基质颗粒

4讨论

 AD是一种与年龄相关的神经系统退行性疾 病,P淀粉样蛋白沉积成老年斑是AD病理标志,并 且被认为直接损害学习能力和记忆[13],其中Ap^

够自我组装形成寡聚体和淀粉样纤维而具有很强的 细胞毒性;A Pw作为它的反序列肽缺乏了自我组 装及构成毒性寡聚态的能力不具有细胞毒性故而 在许多研究中作为APi-2的对照肽[14]条件恐惧放 射状迷宫Morris水迷宫实验Y迷宫实验等均是 AD行为学评价的常用方法[15-16]AD患者后期多伴 有如幻想焦虑抑郁等精神症状旷场实验是评价 实验动物在新异环境中自主行为探究行为与紧张 度的一种方法常用于评价实验动物在新异环境中的 焦虑状态初期就选择Y迷宫进行初筛并配合旷 场实验评分既可避免Morris水迷宫初筛大鼠会遗 留对平台记忆干扰后期Morris水迷宫测试结果又 可排除大鼠情绪原因引起自主活动差异而影响*终 的测试结果造模后大鼠Morris水迷宫实验测定结 果显示模型组逃避潜伏期延长在原平台象限的游 泳时间和游泳距离百分比缩短假手术组未见明显 变化表明模型大鼠学习记忆受损

AD发病机制复杂多种因素参与了它的发病过 程其中氧化应激可能在其中占有重要的地位大量 实验研究及回顾性研究均提出AD发生fa展与氧化 应激密切相关[17-19]尽管生理浓度的活性氧在体内 的一些信号通路中起着重要作用但活性氧的过度 产生会引起脂质蛋白核酸等分子损伤MDA是一 种重要的脂质过氧化产物表明了机体受氧化损伤的程 度活性氧的消除主要通过酶促及非酶促两种途径, SOD是体内重要抗氧化酶可通过催化还原态单电 子氧转化为过氧化氢从而qing除体内氧自由基减轻 氧化损伤的程度维持生物体细胞成分正常的结构 和功能[20]通过抗氧化手段进行干预或可延缓** 向AD终末的进展本实验结果显示模型组血清及 皮质抗氧化酶SOD活性均有下降MDA活性均表 现升高趋势中药组可以升高皮质及血清中的SOD 活性降低MDA活性表明bu肾填髓方可以增强机 体的抗氧化能力拮抗过度产生的氧自由基这与姜 招峰等™的研究有共通之处其研究表明海马及皮 层部位的氧自由基损伤与大鼠记忆及学习能力密切 相 关

由于线粒体电子传递中不可避免的出现电子泄 露成为了机体活性氧主要产生来源90%内源性氧自 由基均由线粒体而来线粒体自身亦可受到氧自由基的 破坏加剧线粒体的损伤从而形成恶性循环[22]本 研究通过电镜观察线粒体超微结构结果显示模型 组线粒体形态不完整结构破坏体积变小分布紊 乱且数目减少出现空泡化改变表明AD模型鼠线 粒体整体结构受损大鼠灌服中药bu肾填髓方能使 线粒体组织结构部分恢复大小形状变得规则数 目增多表明bu肾填髓方对受损的AD大鼠线粒体 结构的破坏有改善作用

AD属于中医学痴呆”“呆证的范畴病性以 本虚标实为主以髓海空虚为本痰浊瘀血阻络为 标而肾虚髓空是其根本原因肾与脑之间有着密不 可分的联系,“痴呆的中医药zhi疗多集中在bu肾填 髓老年痴呆临床辨证分型流行病调查也发现髓海 不足证在所有证型中出现频次zui高[23]。bu肾填髓方 基于经典方剂孔圣枕中丹”(千金方》)化裁而成, 以yin羊藿何首乌为君药功效在于滋yin bu肾强精 益血臣药龟板龙骨强精益髓增慧添智佐以远 志石菖蒲开窍豁痰醒神益智纵观全方yao物组成, 主要功效在于bu肾填髓且兼顾了化痰开窍现代药 理研究表明yin羊藿中的成分yin羊藿苷可以通过抗 氧化应激、kang炎、qing除自由基抑制乙酰胆碱酯酶的 活性以及抑制AP聚集等途径发挥对AD的改善作 [24]何首乌主要水溶性成分二苯乙烯苷可改善拟 痴呆大鼠的学习记忆能力提高大鼠海马组织CA1 区脑啡肽酶及低密度脂蛋白相关受体1表达增强 对AP的降解和转运[25]远志粗提物经D101大孔吸 附树脂富集后发现皂苷类成分和黄酮类成分或许能 通过抗氧化应激改善小鼠的学习记忆功能m石菖蒲 的主要有效成分P-细辛醚可以改善认知功能其作用 机制包括了抑制炎症因子IL-ipTNF-a的分泌及下 调AQP4的表达来保护星形胶质细胞[27]

本实验显示bu肾填髓方可以改善AD大鼠的学习 记忆能力增强抗氧化应激能力且能够改善线粒体的 结构其机制可能与改善线粒体相关的氧化应激有 关更深人的机制研究还需下一步进行