目的：穿梭实验系统比较不同缺血再灌注时间对短暂性大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）大鼠的运动及认知功能的影响。
方法：取穿梭箱主动回避率超过70%的大鼠60 只随机分为4 组：根据Bederson 评分及存活率缺血再灌注60min 组（n=8）、90min组（n=11）、120min组（n=7）及假手术组（n=7）纳入*终行为学研究。术后28 天行TTC染色计算梗死体积。于术后第1、3、7、14、21、28 天进行改良神经功能缺损程度（mNSS）评分，第3、7、14、21、28 天进行前肢抓握力测试；于术后第14、21、28天进行穿梭箱测试。
结果：缺血再灌注时间越长，大鼠的生存率越低（χ2=12.694，P=0.005）；梗死体积随缺血再灌注时间增加而增大（F=14.056，P=0.01）。缺血时间越长，mNSS评分越高（F=9.100，P=0.001）；梗死组较假手术组抓握力量减小（F=11.630，P＜0.05）；穿梭箱实验显示各时间点90min组主动回避率较假手术组降低（P＜0.05），120min组第14、21 天时较假手术组主动回避率降低（P＜0.05）。
结论：tMCAO大鼠随缺血再灌注时间延长，运动功能障碍严重程度增加，缺血60min 再灌注不出现认知功能障碍，且因运动功能自发性恢复速度快，不适用于认知功能及长期运动功能行为学测试。缺血90min、120min出现认知功能障碍。
关键词 ： 短暂性大脑中动脉闭塞；缺血再灌注；运动；认知
我国每年有新发脑卒中患者约200 万人，脑卒中已成为我国的主要致残病因[1]，脑卒中后常见的问题包括运动、吞咽、言语、认知功能障碍等。卒中后认知功能障碍（post stroke cognitive impairment,PSCI）的发病率高达64%且长期存在[2]，严重影响其他功能的康复，因而对认知障碍的研究尤为重要。目前脑卒中相关动物模型有多种，但大多数是针对运动功能障碍，而认知功能障碍动物模型较少。短暂性大脑中动脉闭塞（transient middle cerebralartery occlusion, tMCAO）能很好地模仿人类因血管闭塞引起的脑梗死这一**发病模式，常被用于认知功能相关研究，但tMCAO模型是否会出现认知功能障碍仍有一定争议，且各实验室对缺血再灌注时间的选择不一，具有一定随意性，常见的缺血时间为120min、90min、60min[4]，不同缺血再灌注时间对tMCAO大鼠的运动及认知的影响有何区别，少有研究涉及。本研究就不同缺血再灌注时间对大鼠的运动及认知功能的影响进行研究，为今后tMCAO模型相关实验的缺血再灌注时间选择提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物：SPF 级雄性SD 大鼠60 只，体重235—255g，由广东中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（粤）2013-0034，所有动物均饲养于中山大学（生命科学学院中药与海洋**实验室）SPF 级实验环境中，许可证号：SYXK（粤）2014-0020，采用已**颗粒型大鼠饲料喂养，饮用****水，环境温度控制在20—25℃。
1.1.2 主要仪器与试剂：YLS-13A大小鼠抓力测试仪（上海嘉适科学仪器有限公司），XR-XC105 型（上海尊龙凯时人生就是博信息科技有限公司）穿梭实验视频分析系统（Shuttlebox system），4—0 硅胶包被线栓（直径0.37±0.02mm）（深圳瑞沃德生命科技有限公司），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，美国Sigma）。
1.2 实验方法
1.2.1 穿梭箱实验：采用XR-XC105 型穿梭实验视频分析系统，穿梭箱内部（226×213×350）mm，底部设不锈钢栅栏，使用电流作为非条件刺激，电击动物足底部。顶部设噪声发生器（声音）及两侧各有一光源作为条件刺激。适应5min 消除探究反射后予光声刺激5s，继予电击10s，间隔10s 后进入下一轮。
若在**刺激5s 内大鼠逃向**区，则为主动回避反应，系统自动停止当次训练；如果在**刺激5s内大鼠未逃向**区，则给予0.5mA 交流电刺激10s，在电击后逃向**区为被动回避反应阳性，否则为无反应。每只大鼠测试20 次，系统自动记录主动回避反应次数（active avoidance response,AAR）、被动回避反应次数（positive avoidance response,PAR）、总回避反应（general avoidance response,GAR）为AAR+PAR，AAR与总测试次数的比值为主动回避率（active avoidance responserate, AARR）。SD大鼠预训练5 天，每天20 次，选择*后2 天主动回避率超过70%的进行下一步实验，并于术后14、21、28 天测试，以AARR为检测指标，反映大鼠的学习记记忆能力及执行决策能力。
1.2.2 实验动物模型制作：将预训练达标的SD 大鼠，予以10%的水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射麻醉，局部**备皮，颈部正中切口2—2.5cm，分离颈总动脉（CCA），预置缝线备用，沿左侧CCA 分离颈外（ECA）、颈内动脉（ICA），结扎并游离ECA 及CCA近心端。微血管夹夹闭CCA 远心端，于CCA 两端之间处剪一小口，将制备好的直径为0.375mm尼龙线沿切口轻轻插入，松开微血管夹并将尼龙线轻轻插入ICA，直到稍感阻力，若尼龙线插入深度为10mm，则考虑线栓插入翼颚窝，往后退一点，稍提起ECA，使之成直线，再往里插线栓，直到再次感觉到阻力，结扎CCA远心端，将尼龙线外留1cm 以备拔线栓时使用，根据分组不同随机分为线栓插入60min、90min、120min 后拔出。假手术组大鼠麻醉同上，但只暴露、分离结扎血管，而不插线栓。
1.2.3 模型评价：采用改良的Bederson 评分方法进行神经功能评分：0 分：无神经功能缺失体征；1 分：提尾时损伤对侧前肢屈曲；2 分：前肢屈曲及对侧抵抗力下降；3 分：向对侧转圈；4 分：向对侧转圈及意识障碍；5 分：死亡。神经功能评分1—3 分的大鼠纳入本研究，*终60min 组8 只，90min 组11 只，120min组7只，假手术组7只纳入研究。
1.2.4 改良大鼠神经功能缺损评分（modified neurologicalseverity scores, mNSS）[7]：该评分包括运动功能、感觉功能和反射缺失3 大项，共计18 小项。未能完成该项检查或反射缺失计1 分。10—18 分为严重损伤，5—9 分为中度损伤，1—4 分为轻度损伤，于术后第1、3、7、14、21、28天进行评分。
1.2.5 抓握力测试：采用YLS-13A大小鼠抓力测定仪测试大鼠的抓力，将大鼠放置在抓力板上，抓住鼠尾轻轻向后牵拉，待大鼠抓牢抓力板后，均匀用力后拉，致使动物松爪，仪器自动记录大鼠的*大抓力，将仪器与PC机联机读取数据进行处理。评价右侧瘫痪前肢抓力的强度时，要用胶带包裹左侧未瘫痪前肢。每次测试抓力5 次，取平均值，于术后第3、7、14、21、28天进行测试。
1.2.6 TTC 染色：于第28 天取大鼠水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射麻醉固定，开胸暴露心脏，从心尖处插入导管，先快后慢灌注生理盐水200ml，置于-80℃冰箱5min，再于脑槽中取冠状面均匀切成2mm厚脑片，取5 片放入2%的TTC 溶液（37℃）避光中染色20min，4%甲醛缓冲液固定。24h 后用相机拍照，其中粉红区为正常脑组织，白**为梗死区（见图2）。采用Image-Pro Plus 6软件计算梗死体积分数，计算公式为梗死体积/（梗死体积+未梗死体积）×100%。
1.3 统计学分析
应用SPSS 20.0 进行数据分析，mNSS、抓握力量结果以平均值±标准差表示，穿梭箱实验结果以平均值±标准误表示。mNSS、抓握力量、穿梭箱实验采用重复测量设计的方差检验，若有交互效应，各时间点进行单因素方差分析，各时间点各组之间用LSD-t 检验进行两两组间比较，脑梗死体积采用单因素方差分析，各组之间用LSD-t 检验进行两两组间比较，各组生存率采用log-rank检验分析比较。
2 结果
2.1 生存率比较
实验大鼠随缺血再灌注时间的延长，生存率降低（χ2=12.694，P=0.005），见图1。死亡主要集中在造模后的前7 天，死亡原因包括蛛网膜下腔出血、癫痫、进食障碍等。因死亡、Bederson 评分不达标*终每组入组大鼠数量不同。
2.2 梗死体积的比较
实验组大鼠随缺血再灌注时间延长，梗死体积变大（F=14.056，P=0.01），90min、120min 组与60min组比较有显著性差异（P＜0.05），90min、120min 组多为皮质及皮质下梗死，而60min 组多为皮质下基底核区梗死。
2.3 改良神经功能缺损程度评分结果
缺血再灌注各组均有不同程度的运动、感觉功能障碍，缺血时间越长，mNSS评分越高（F=9.10，P=0.001），各组随观察时间的延长，运动、感觉功能逐渐改善（F=187.87，P＜0.01），前7 天恢复*快，后恢复速度减缓（见表1，图3）。
2.4 缺血再灌注时间对大鼠患侧前肢抓握力量的影响造模后缺血再灌注各组患侧前肢抓握力均有不同程度降低（F=11.630，P＜0.01），随时间缓慢恢复（F=120.780，P＜0.01），缺血时间越长，恢复所需要的时间越长，60min 组在第7 天即恢复正常，与假手术组比较差异无显著性意义（P＞0.05），90min 组第28天与假手术组比较差异无显著性意义。
2.5 穿梭箱实验结果
重复测量方差分析各组之间比较（F=3.516，P＜0.05），无时间、交互效应（P＞0.05）。进一步两两比较，与假手术组相比，90min 组主动回避率在各时间点都有明显降低（P＜0.05），而120min 组也较假手术组有降低，在第14、21 天时差异有显著性意义（P＜0.05），第28 天时差异无显著性意义（P=0.052），60min组在各时间点与假手术组无显著性差异（P＞0.05），见图5。
3 讨论
大鼠MCAO模型问世已经超过三十年，应用越来越广泛。线栓法大脑中动脉梗死模型因其与人类因血管闭塞引起的脑梗死发病模式*类似、可重复性好等优点，成为近年来神经实验*常用的模型之一，在脑梗死后神经保护研究中有超过40%采用了线栓法大脑中动脉梗死模型，而不同的缺血再灌注时间对于运动、认知功能的影响有何区别尚不清楚。本研究采用行为学实验对不同缺血再灌注时间tMCAO 大鼠的运动、感觉、认知功能进行了4 周的检测，为今后tMCAO大鼠相关行为学检测实验，特别是认知功能行为学检测选择缺血再灌注时间及检
测时间提供参考。
本研究发现tMCAO大鼠的缺血再灌注时间越长，mNSS 评分越高，患侧前肢的抓握力量越差，提示tMCAO 大鼠运动、感觉功能损伤程度受缺血再灌注的时间的影响，与既往研究一致，梗死大鼠运动功能术后1 周内改善的速度较快，随后速度逐渐减慢，与人类卒中的恢复类似，且缺血再灌注时间越长所需要恢复到正常水平的时间越长。60min 组在1周后运动功能改善接近于假手术组，可能的原因是缺血时间短，损伤程度轻，其次可能是缺血60min 后再灌注大部分是皮质下基底核区梗死，而皮质下梗死的恢复速度也更快，因而60min缺血再灌注时间不适用于对大鼠长期运动功能相关的行为学实验。
人类脑梗死3 个月后有62.6%出现血管性认知功能障碍，而大鼠的MCAO模型是否会出现认知功能障碍及其可能的机制仍然未明确。有研究认为MCAO模型仅会有运动功能障碍而不会出现认知功能障碍，多数研究显示MCAO模型大鼠存在认知功能障碍[13—14]，亦有分析认为，运动功能障碍影响了大鼠在行为学实验中的表现，从而出现认知功能障碍的假阳性结果[15]。记忆在认知功能中有着举足轻重的作用，一般认为与记忆密切相关的海马主要由大脑后动脉供血，理论上MCAO不会造成海马的损伤，但实际研究发现，线栓法MCAO会在一定程度上减少海马的血流量，造成一定的损伤。此外由于梗死后颅内压增高、水肿、炎症等原因海马神经元会发生迟发性死亡，且随时间的进展，神经元死亡的数量增加，这也在某种程度上解释了为什么认知功能障碍出现的较晚，且进展性加重。也有研究认为[18]，tMCAO模型海马γ-氨基丁酸抑制性神经元的上升，细胞外调节蛋白激酶激活的下调，导致长时程增强受到抑制，因而出现认知功能障碍并呈进展性。某些皮质损伤，如新皮质、额叶皮质，也是认知功能障碍出现的原因。部分由梗死灶单独解释不了的认知功能障碍，可能是因为双侧大脑的N-甲基-D-天冬氨酸受体的长期的下调和内吞所导致的。
既往对MCAO大鼠认知功能研究多采用水迷宫检测大鼠的空间记忆能力，但对大鼠的运动功能及体能要求较高，且浸入水中可能引起***或其他应激效应，与脑损害或药理学操作间的相互作用具有不确定性，而穿梭箱实验主要研究大鼠的学习记忆能力及执行决策能力，相比水迷宫对大鼠的运动功能要求相对较小，抗外界环境干扰能力强。本研究显示缺血90min、120min 后再灌注的大鼠的穿梭箱主动回避率降低，提示大鼠出现学习记忆相关认知功能的损害，但并没出现明显的认知功能进行性下降，与既往研究不完全一致。出现这种差异的原因可能是认知功能评定的方法和时间不同，上述研究中采用Morris 水迷宫测试，本研究使用穿梭箱实验，并进行了强化性预训练，检测时间仅为4 周，且为重复测量设计，而研究显示重复测量能改善tMCAO大鼠功能障碍。
本实验发现，大鼠tMCAO 后死亡主要集中在术后1 周，死亡原因有多种，包括蛛网膜下腔出血、窒息、癫痫、肠胀气等，但*重要的原因是术后大鼠运动功能差，无法正常进食，进而体质下降，*终死亡。本研究也证实运动功能差的120min 组生存率明显低于60min 组，因而为了降低死亡率，术后的食物选择、进食方式及护理显得尤为重要。
研究发现，SD大鼠的梗死体积对缺血再灌注时间敏感，缺血时间长梗死体积大，与本研究结果一致。研究认为，梗死体积与早期的行为学有相关关系，而与晚期的行为学表现不相关，可能原因是梗死大鼠对侧大脑半球会产生适应性反应，发出运动感觉纤维跨越中线，从而出现运动感觉功能自发性恢复。
本研究就不同缺血再灌注时间进行研究，通过多种行为学方法对tMCAO 大鼠的运动、感觉及认知功能进行综合评价，认为缺血60min 再灌注不出现认知功能障碍，且运动功能自发性恢复的速度快，因而不适用于认知功能相关的实验研究及长期运动功能相关的行为学检测。缺血90min、120min 再灌注组出现认知功能障碍，适用于认知功能相关研究，但为*大程度地排除运动功能障碍带来干扰，认知功能相关行为学检测*好安排在术后较长的时间范围（28 天），运动功能恢复到一定程度。值得一提的是，缺血再灌注时间并不是MCAO模型**影响因素，动物种属、线栓的类型及插入深度等都是tMCAO模型成功的关键，相关因素的问题有待进一步的研究。