摘要:目的研究匹罗卡品(PILO)诱导的颞叶癫痫小鼠的恐惧记忆行为学变化规律，探讨此行为学检测评价颞叶癫痫的可行性。方法建立PILO小鼠癫痫模型，分P ILO注射2 周组(n= 11). PILO注射6周组(n = 7)和PILO注射l0周组(n = 11），同时设正常对照组(n = 10)。对各组小鼠进行场景恐惧记忆实验，同时进行海马N issl染色观察。结果经过声音提示恐惧记忆训练，小鼠恐惧记忆的获得受到了损害。场景恐惧记忆测试发现PILO注射2周组小鼠的僵住时间与对照组无统训一学差异(P>0.05)，而6周组和10周组则显示明显的恐惧记忆减弱(P <0.05;声音提示的恐惧记忆测试发现P ILO注射2周组和6周组小鼠僵住时间与对照组无统计学差异((P > 0.05)，而10周组则出现明显的恐惧记忆减弱((P< 0.05)。Nissl染色显示，P ILO注射6周和10 周组小鼠海马CA3的锥体细胞脱失，排列稀疏，间隙增大，许多细胞胞质中的N issl小体减少或消失。结论P ILO诱导的颞叶癫痫小鼠恐惧记记忆的形成及场景恐惧记忆的回忆都受到了损害，但声音提示的恐惧记忆得到了一定程度的保留。恐惧记忆行为学的变化可能会成为评价颞叶癫痫的一个临床指标。
癫痫患者，特别是难治性颞叶癫痫患者的记忆功能常受到较为严重的损害。匹罗卡品引起的动物癫痫样发作在一定程度上反映了人类颞叶癫痫的特征，与人类癫痫发作有相似之处，包括发作时的脑电图表现、发作的癫痫放电扩散、海马神经元的缺失、苔鲜纤维出芽及齿状回细胞弥散等，因此，其作为一种有效的颞叶癫痫模型广泛应用于难治性颞叶癫痫的研究。
研究表明，情绪是由大脑的回路所控制的，这个回路是由前额皮层、杏仁核、海马、前部扣带回和腹中央纹状体等脑区构成。这些结构整合加工情绪信息，产生情绪体验和行为，海马和杏仁核在其中起关键的作用。研究表明，海马是空间记忆的核心角色，而杏仁核在恐惧记忆中起重要的作用。由于P ILO颗叶癫痈小鼠的海马和杏仁核都受到损伤，有理推测其恐惧记忆将受到损害。对于红藻氨酸(IAA)点燃癫痈模型和杏仁核点燃癫痈模型，已有相关研究，但利用P ILO模型探讨恐惧记忆行为与颞叶癫痫相关性的研究却很少。本研究建立P ILO颗叶癫痈小鼠模型，在此基础之上运用场景恐惧实验系统，初步探索颞叶癫痫小鼠的恐惧记忆功能，探讨利用场景恐惧测试评价颞叶癫痫的可行性。
1材料与方法
1.1动物和试剂 清洁级雄性健康C57BL /6成年小鼠，7- 8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号:SCXI（沪）2007 - 000使用许可证号:SYXI（沪）2003 - 0020 PILO和阿托品购自Sigma公司，地西伴购自上海旭东海普药业有限公司。恐惧制约实验系统，货号：XR-XC404，上海尊龙凯时人生就是博信息科技有限公司。
1.2癫痫模型的建立和分组先用阿托品(1 mg/kg)腹腔注射小鼠，以阻断外周胆碱能作用;30min后腹腔注射P ILO ( 340 mg /k g)，注射后密切观察动物的癫痫性发作情况。致痫处理后按照R ac ine标准判定癫痈的发作程度，达到3-5级入选实验组，未达3级均筛除。入选的动物癫痫发作后，于出现癫痫持续状态60 min后给予地西伴(l0mg/kg)腹腔注射，以抑制癫痈发作，减少动物死亡。凡SE持续时间未达到60mn或中途死亡的动物均筛除。共有32只小鼠成功建立模型，入选实验组，并进一步分为PILO注射2周组(n= 11),PILO注射6周组(n= 7)和PILO注射10周组(n=11);另设正常对照组(n=10)。
1.3场景恐惧记忆实验
1.3.1实验装置:在专用的动物行为学实验室里，采用一个独立的隔离箱作为行为学测试的隔离大环境，里面安装有 2W的白炽灯，同时有小排气扇通风。采用A, B两个体积和形状不同的箱子作为行为学测试的小环境。A箱为立方形，底部为不锈钢栏，用于足部电刺激，顶部安装有扩音器，用于声音刺激;B箱为圆筒形，为底部不带不锈钢栏的塑料箱。以A箱作为训练箱，于训练后1<将动物放于其中，直接触发场景恐惧记忆的回顾。B箱作为非应激箱，将动物置于其中，改变周围的空间环境。每次实验前后都用酒精擦A, B两箱，以免气味影响实验结果，使实验条件统一。将动物放在动物行为学实验室的隔壁房间，每次取出1只动物，放在一个相同的笼子里带到动物行为学实验室进行实验。实验在17 00 -19. 00之间进行。
1.3.2声音提示恐惧记忆训练:实验第1天，将动物暴露在A箱里。适应120 s后在第120, 180, 240, 300和360 s处分别给予持续30 s的白噪声(75 dB)刺激，在每次白噪声刺激*后2s同时给予持续2 s的足部电击(0.2mA)。整个实验持续400s,通过摄像头观察动物的僵住(指动物除了呼吸运动外，全身其他躯体运动全部停止的状态)时间。
1.3.3场景恐惧记忆测试:实验第2天，将动物置于A箱120s不给任何声音或电刺激。通过摄像头观察动物的僵住时间。
1.3.4声音提示的恐惧记忆测试:实验第3天，将动物置于B箱。0-30s是适应时间，第30s和90 s处给予持续30 s的白噪声(75dB)刺激。整个实验持续150s通过摄像头观察动物的僵住时间。
1.4 Nissl染色 各组随机抓取3只小鼠进行Nissl染色。打开胸腔，暴露心脏，用4%多聚甲醛依次通过心脏灌注后，断头取出完整脑组织，放入4%多聚甲醛中固定，然后移入30%蔗糖磷酸缓冲液中，4℃过夜。在冰冻切片机上切取30um厚的冠状脑切片，进行N issl染色形态学观察。
1.5数据采集应用superfcs软件进行数据采集。
1.6统计学分析应用SPSS 10 0软件进行统计学分析。根据方差齐性与否分别采用参数检验和非参数检验。方差齐性资料的均数间比较用t检验，非齐性资料用秩和检验，P< 0.05表示差异有统计学意义。
2.2恐惧记忆行为测试结果
2.2.1声音提示恐惧记忆训练:多数动物的僵住行为于开始训练即出现，并随训练次数的增加而明显加重。在声音提示恐惧记忆训练中，对照组和实验组动物的僵住时间比例均随着训练时间的延长而逐渐上升。从开始给予白噪声(120 s)和足部刺激后，动物开始出现僵住的动作;240 s后，对照组和实验组的僵住时间出现统计学差异(P < 0.01)，但各实验组之间差异无统计学意义(P >0.05)(图1) o
2.2.2场景恐惧记忆测试:P ILO注射2周组小鼠的僵住时间与对照组比较，差异无统计学意义(p>0.05);而PILO注射6周组和10周组小鼠的僵住时间明显减少(P < 0.05)，但此两组之间差异无统计学意义(P >0.05)(图2).
2.2.3声音提示的恐惧记忆测试:P ILO注射2周组和6周组小鼠的僵住时间与对照组比较，差异无统计学意义(P > 0.05);而PILO注射10周组与对照组比较有统计学差异(P < 0.05)(图3) 2.3 N issl染色结果 对照组小鼠海马结构清晰，CA 3的锥体细胞排列整齐、密集，胞质中N issl小体清晰可见(图4A 1, 4A 2) . PILO注射2周组与对照组比较变化不大(图4B1, 4B2)。PILO注射6周组小鼠海马CA 3的锥体细胞脱失明显，排列相对比较稀疏，细胞间隙增大，Nissl小体减少或消失，可见细胞空泡变性、核固缩浓染等(图4C1, 4C2)。PILO注射10周组也同样观察到小鼠海马CA3的锥体细胞脱失，排列稀疏，间隙增大，许多细胞胞质中的N issl体减少或消失，也可见细胞空泡变性、核固缩、核碎裂等现象(图4D1, 4D2)。
3讨论
癫痫是临床上常见的神经系统**，其发病机制与脑内兴奋性氨基酸递质和抑制性氨基酸递质平衡失调有关。由于病例标本获取困难，目前癫痫的研究多数通过制作动物模型来进行。癫痫动物模型的制作主要有化学诱导和电诱导两种方式。化学诱导简便易行，起效快。P ILO诱导的癫痫动物模型是一种比较成熟的颞叶癫痫模型，在发作行为脑电图、痫性放电扩散等方面与人类的颞叶癫痫极为相似;其病理改变同人类颞叶癫痫的海马细胞缺失、苔鲜纤维出芽等也极为类似;同时其发展的不同阶段，包括急性损伤期、潜伏期、癫痫自发性发作的慢性期，也符合人类颞叶癫痫发生的特点，因此国际上将其广泛用于颞叶癫痫的研究。
足部电击是一种能导致动物恐惧的刺激，是研究动物恐惧行为学的一种简便而敏感的方法。在本研究中，足部电击是非条件刺激，A, B箱和白噪声则是条件刺激，利用两个不同的箱子对实验动物的场景恐惧记忆进行测试。在场景恐惧记忆测试(第2天)时，仍然使用训练的A箱是为了检测实验动物对空间提示的恐惧记忆的表现;而在声音提示恐惧记忆测试(第3天)时，把A箱变换为B箱，是为了改变环境，避免空间记忆干扰声音提示的恐惧记忆的测试。
本研究结果提示，在第3次足部刺激后，对照组和实验组僵住时间开始出现明显差异(P< 0.01)，说明小鼠恐惧记忆的获得出现了明显的损害;而实验组之间未出现明显差异，提示短时程恐惧记忆的形成在PD。致痫早期就受到一定程度的损伤，而且这种损伤并不随癫痫发作时间的延长而加重。
P ILO颞叶癫痫小鼠的海马和杏仁核均受到了损伤。海马一直以来被认为与空间记忆的关系*为密切，许多研究均表明海马的损伤会导致空间记忆受损;而杏仁核被认为在恐惧记忆中起核心作用。本研究中，在第2天的场景恐惧记忆测试中，PILO注射2周组的小鼠没有出现场景恐惧记忆的损害，而PILO注身寸6周组和10周组与对照组比较，有统计学差异(P < 0.05)，同时P ILO注射6周组和10周组之间差异无统计学意义(P > 0.05)，这可能表明小鼠在癫痫的慢性期出现了海马的损伤，但并未因为致痫时间的增加而使场景恐惧记忆受到更加严重的损害。
在杏仁核的刺激癫痫模型上发现了对场景恐惧记忆有损害，但对不连续的声音刺激没有损害。在本研究中，PILO注射2周组小鼠的声音恐惧记忆也没有受到损害，但随着时间的延长(6周和10周)，声音的恐惧记忆受到了一定程度的损害。此模型的组织病理学研究提示，随着癫痫发作的时间增加，会出现损害杏仁核的情况。杏仁核在形成恐惧记忆的回路中扮演着重要的角色，因此它的损伤会导致恐惧记忆受到一定程度的损害。有研究表明杏仁核的损伤程度与恐惧记忆的损害程度没有直接的相关性。
本实验结果表明，P ILO颞叶癫痫小鼠短时记忆和场景恐惧记忆受到了损害，但声音恐惧记忆得到了一定程度的保留。恐惧记忆行为学的变化也许可以作为评价颞叶癫痫的一个指标应用于临床。