SuperFcs条件性恐惧实验方法案例以及注意事项
----毛冬青改善血管性痴呆小鼠学习记忆作用的研究
摘要：目的观察毛冬青提取物（pubescent holly root extract，PHRE）对血管性痴呆（VD）模型小鼠学习记忆能力的影响，探讨其潜在的作用机制。方法采用反复夹闭、再通双侧颈总动脉同时尾静脉放血的方法制备小鼠痴呆模型，随后将小鼠随机分为假手术组，模型组，尼莫地平对照组（30 mg·kg-1），毛冬青低、中、高剂量组（5，10，20 g·kg-1），各组灌胃相应**10 mL·kg-1，连续35 d，从第30 天开始进行行为学检测，末次给药后收集大脑样本，HE 染色观察病理学变化、**组化法及Western Blot 法检测Bcl-2、Bax 蛋白表达。结果与假手术组比较，模型组小鼠的恐惧记忆时间明显缩短，大脑海马区神经元细胞病变严重，海马区Bcl-2/Bax 蛋白表达的比值降低，且主要分布于胞质。与模型组比较，各**组小鼠的恐惧记忆时间明显延长，大脑海马区的组织病变情况改善，且海马区Bcl-2/Bax 蛋白表达的比值显著增加。结论毛冬青提取物可能通过上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax 蛋白表达，减少细胞凋亡，保护神经细胞，从而改善血管性痴呆小鼠的学习记忆功能。
关键词：毛冬青提取物；血管性痴呆；学习记忆能力；细胞凋亡
随着全球老龄化的出现，慢性**痴呆越来越引起人们的关注。其中，血管性痴呆（vasculardementia，VD）是继阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）之后诱发老年期痴呆的**大病因，也是目前**可以预防的脑退化**类型。因此，研发有效预防及**VD 的**具有重要的意义。毛冬青为冬青科冬青属植物毛冬青（Ilex pubescens Hook .et Arn）的干燥根或叶，是我国南方常用中药，具有****、消肿止痛、****等功效，大量研究表明，毛冬青的各类制剂对冠心病、脑血栓、血栓性脉管炎等心脑血管**均有显著疗效。本研究通过观察毛冬青提取物（pubescent holly root extract， PHRE）对血管性痴呆小鼠学习记忆、海马区病理变化及凋亡相关蛋白表达的影响，探讨毛冬青改善血管性痴呆学习记忆的可能作用机制，为中医药防治VD 提供实验依据。
1 材料与方法
1.1动物KM 种小鼠，雄性，SPF 级，体质量32～35 g，由广东省实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（粤）2013-0002。实验动物喂养环境：温度23～25 ℃；相对湿度（50±5）%，常规饲料饲养。1.2 **及主要试剂毛冬青饮片分别购于康美药业股份有限公司和广州大翔药业有限公司，经广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波教授鉴定为毛冬青植物Ilex pubescens Hook. et. Arn.。取毛冬青饮片300g，粉碎成粗粉，加入60 %乙醇加热回流提取2 次，依次用6 倍量和4 倍量溶媒分别提取1.5 h 和1 h，滤过后合并药液，减压浓缩至150 mL，即得PHRE 储备液，用时以蒸馏水稀释至所需浓度。
尼莫地平片，拜耳医药保健有限公司，批号：BJ24208。SABC **组化染色试剂盒，博士德生物，批号： 11C29C。β-actin 抗体， bioworld， 批号：AP0060。Bcl-2 抗体，abcam，批号：ab182858。Bax抗体，abcam，批号：ab32503。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：IH-0011。
1.3仪器AUM220D 电子分析天平，日本Shimadzu公司；超低温冰箱，美国Thermo 公司；制冰机，日本Sanyo 公司产品；高速冷冻离心机，中国中科中佳科技仪器有限公司； 多功能酶标仪， 美国PerkinElmer 公司；CM1950 冰冻切片机，ASP200S 脱水机，EG1160 包埋机，RM2135 切片机，ST5020 染色机，DC300 光学显微镜，均为德国Leica 公司；小鼠条件恐惧试箱、XR-XC404 条件性恐惧分析系统，上海尊龙凯时人生就是博科技有限公司。
1.4 分组、模型制备及给药取雄性KM 种小鼠，采用颈总动脉结扎反复缺血再灌注的方法[5]制备经典VD 模型：小鼠腹腔注射3.5 %水合氯醛（10 mL·kg-1）全身麻醉，分离双侧颈总动脉，用动脉夹阻断其血流30 min，松开动脉夹恢复血流10 min，重复3 次。于第1 次阻断血流5 min 后， 小鼠断尾放血约0.3 mL，冷凝止血。第3 次血流再灌注后30 min，观察小鼠呼吸、心跳，待其正常后即可缝合皮肤。假手术组小鼠仅暴露双侧颈总动脉同等时间即可缝合皮肤。造模后第2 天，除假手术组外，将模型小鼠随机分为5 组，分别为模型组，尼莫地平对照组（30 mg·kg-1），PHRE 低、中、高剂量组（含生药量5，10，20 g·kg-1），每组12 只。各组小鼠按10 mL·kg-1灌胃给药，连续35 d，每天1 次，假手术组及模型组灌胃等体积的蒸馏水。
1.5 行为学检测
1.5.1爬杆实验第30 天给药后2 h，进行爬杆实验测试。将一根长50 cm、粗1.5 cm 的竹竿固定在泡沫盒上，竹竿用纱布包裹以防打滑，小鼠头朝下放置于竹竿顶部，记录小鼠爬完杆长全长所需时间。正式记录评分之前，训练小鼠爬杆3 d，每日1 次，确保每只小鼠学会爬杆。根据爬杆时间进行评分，若小鼠坠落评7 分，不动评6 分，40 s 掉头评5 分，20 s 掉头评4 分，爬完全长31～40 s 者评3 分，21～30 s 者评2 分，11～20 s 者评1 分，0～11 s 者评0 分。
1.5.2条件恐惧实验给药34 d 后进行条件恐惧实验，实验分为两个阶段，**阶段为恐惧训练阶段，即第34 天给药2 h 后，将小鼠放入恐惧箱中，从20 s 开始给予声刺激（75 dB，2000 Hz），持续10 s，从25 s 开始给予光刺激，持续5 s，从28 s 开始足部电刺激（0.8 mA）2 s。共进行4 个循环，间隔时间各为15 s。**阶段为测试阶段，即第35 天给药2 h 后，将小鼠放入恐惧箱中，场景与受训阶段场景一致，提供相同的声、光等提示性信号，但不给予电击，动物仍将会表现出恐惧反应，通过观察动物的僵直时间来反映动物对恐惧的记忆能力。
1.6样本采集恐惧实验结束2 h 后，每组随机选取6 只小鼠，腹腔注射3.5 %水合氯醛（10 mL·kg-1）麻醉，通过心脏灌注4 %多聚甲醛固定脑组织，灌注完成后，取脑组织置于10 %中性福尔马林溶液中固定，用于病理切片制作。其余小鼠断头处死，迅速摘取大脑，分离海马区，用于**组化及Western Blot 检测。
1.7 HE 染色观察固定好的脑组织经修整、脱水、包埋、切片、HE 染色、封片等程序后，使用光学显微镜观察小鼠海马组织CA1 区组织结构的变化。1.8 **组化检测Bcl-2、Bax蛋白的分布及表达用Tissue OCT-Freeze Medium 包埋小鼠大脑并制作冰冻切片。严格按照SABC **组化染色试剂盒说明依次固定、封闭、一抗孵育、二抗孵育、SABC 孵育、DAB 显色、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜观察，并用数码医学图像分析系统进行数码照相及图片分析Bcl-2、Bax 蛋白的分布及表达情况。
1.9 Western Blot 法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达分离小鼠大脑海马区组织，提取总蛋白，BCA 试剂盒进行定量。取50 μg 蛋白样本，用15 %的聚丙烯酰氨凝胶进行电泳80 V、20 min，之后转换为120V、80 min；然后采用湿转法进行转膜300 mA、1 h；TBST 洗膜10 min，3 次；5 % BSA 常温封闭4 h；4 ℃孵育一抗过夜；TBST 洗膜10 min，3 次；37 ℃孵育二抗1 h；TBST 洗膜10 min，3 次；ECL 进行发光，用Image Lab 3.0 软件对Western Blot 成像图进行分析，计算各组蛋白与内参（β-actin）的相对表达值。1.10统计学处理方法采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，数据以“x±s”表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性者使用LSD 检验；方差不齐者使用Dunnett’s 检验。
2 结果
2.1 各组小鼠爬杆评分比较爬杆实验用于评价各组间小鼠肢体协调能力的差异。评分结果显示：假手术组、模型组及各给药组间均无明显差异（P＞0.05），表明本研究采用的VD 造模方法对小鼠的运动及平衡能力没有造成影响。
2.2 PHRE 对小鼠条件恐惧记忆的影响与假手术组比较，模型组小鼠的僵直时间百分比显著缩短（P＜0.05），表明VD 模型复制成功，小鼠的记忆能力下降。与模型组比较，尼莫地平组及PHRE 中、高剂量组小鼠的僵直时间百分比明显延长，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明PHRE 在10~20 g·kg-1范围内对VD 小鼠的记忆能力有明显的改善作用。
2.3 毛冬青提取物对VD 小鼠大脑神经元细胞形态的影响病理组织学检查显示，假手术组小鼠大脑皮层和海马区神经细胞的形态及分布未见异常。与假手术组比较，模型组小鼠神经细胞间质水肿，细胞核浓染、固缩，皮层神经细胞明显减少，且伴有大量胶质细胞增生，多处聚集成堆，大脑海马CA1 区的锥体细胞大量缺失、变性、坏死，齿状回颗粒细胞变性成空泡样。与模型组比较，PHRE 低、中、高剂量组和尼莫地平组小鼠的大脑神经元病变情况有明显改善，体现为胶质细胞增生减少，海马CA1 区锥体细胞病变程度明显减轻。
2.4 **组化法检测VD 小鼠海马CA1 区凋亡蛋白Bcl-2、Bax的分布和表达结果显示，Bcl-2 和Bax呈不连续的环状或者片状分布，主要在胞质表达。与假手术组比较，模型组的Bcl-2 和Bax 蛋白表达明显增加。与模型组比较，尼莫地平组及PHRE 中、高剂量组的Bcl-2 表达增加，Bax 表达减少。表明VD 模型小鼠的海马CA1 区神经元细胞发生凋亡，而在尼莫地平或PHRE 的干预下，凋亡现象减少，提示毛冬青提取物可以减少VD 模型小鼠的海马CA1区神经元凋亡的发生。
2.5 Western Blot 法检测VD 小鼠海马区Bcl -2、Bax蛋白的表达Bcl-2 水平的升高和Bax 蛋白的降低表明细胞对凋亡的抵抗性增强，是**起保护作用的标志。Bcl-2/Bax 的比值越大，则抗凋亡能力越强。结果显示，与模型组比较，毛冬青提取物能提高VD 小鼠海马区Bcl-2 蛋白的表达水平，同时降低Bax 蛋白的表达，即明显升高Bcl-2/Bax 的比值，表明毛冬青提取物可以提高VD 小鼠海马区细胞的抗凋亡能力，从而对VD 小鼠海马区的神经元起保护作用。
3 讨论
本研究通过血流阻断联合放血法复制小鼠VD 模型，经过小鼠智能测试及病理学检查证实模型制备成功。实验结果表明，VD 模型组小鼠恐惧记忆时间缩短，且脑部海马CA1 区神经元发生损伤，而毛冬青提取物能够明显提高VD 小鼠的恐惧记忆时间，降低VD 小鼠神经元细胞损伤的程度，结合其对凋亡蛋白Bcl-2/Bax 的影响可以推断，毛冬青通过抑制海马CA1 区的细胞凋亡而发挥神经保护作用。
大脑海马区损伤会引起血管性痴呆，从而导致认知功能障碍。海马体与大脑记忆有关，并且对脑缺血敏感[10]。大量实验结果表明海马CA1 区椎体神经元细胞的死亡会引起啮齿类、灵长类动物以及人类出现认知功能障碍[11-12]。因此，海马CA1 区锥体细胞对学习和记忆能力至关重要，然而CA1 区对脑缺血尤为敏感，会引起严重的学习和记忆功能退化。病理实验结果表明，VD 模型组小鼠的大脑海马CA1区锥体细胞大量缺失、变性、坏死，并且齿状回颗粒细胞变性成空泡样。毛冬青提取物可阻止CA1 区锥体细胞缺失，从而起到保护海马区神经细胞，改善VD 小鼠学习记忆的作用。
细胞凋亡在缺血再灌注损伤中具有重要的作用。Bcl-2 和Bax 属于Bcl-2 家族蛋白，调控细胞凋亡。Bcl-2 属于抑凋亡蛋白，可以阻止细胞色素C从线粒体释放到胞浆。Bax 属于促凋亡蛋白，通过移位到线粒体膜上促进细胞凋亡，促进细胞色素C 的释放。Bcl-2 通过平衡Bcl-2/Bax 维持线粒体结构稳定。结果表明，与假手术组比较，模型组小鼠海马区Bcl-2 与Bax 蛋白表达均有所升高，可能为小鼠大脑间断缺血后，促凋亡蛋白Bax 表达增加，诱导细胞凋亡，同时由于细胞自身的保护机制，抗凋亡蛋白Bcl-2 表达反应性上调，发挥抑制凋亡的作用。由于Bcl-2/Bax 的比例决定细胞在受到凋亡信号刺激后是否发生凋亡，在VD 小鼠模型中，Bax 蛋白的表达占优势，从而导致海马区神经元细胞凋亡，海马区形态受损，记忆力出现障碍；与模型组比较，毛冬青提取物能够提高Bcl-2 的表达，降低Bax 的表达，从而显著提高Bcl-2/Bax 的比值，使海马CA1 区细胞的凋亡受到抑制。因此，毛冬青提取物可以通过调节海马CA1 区Bcl-2、Bax 的表达，抑制CA1 区的细胞凋亡，从而改善VD 模型小鼠的学习记忆能力。
毛冬青已被广泛应用于心血管系统**的**，疗效确切。近年来，也有学者深入探讨毛冬青对脑损伤的保护作用[14]。本实验结果表明，毛冬青提取物在高剂量时，改善VD 小鼠学习记忆障碍的效果与尼莫地平相似，可通过抑制VD 模型小鼠的脑组织海马区细胞凋亡来提高学习记忆能力，有望发展成为一种新的**血管性痴呆**。