摘要: 目的 研究糖尿病发展过程中大鼠血浆 β-淀粉样蛋白 42( amyloid beta 42，Aβ42) 、胰岛素和血糖的动态变化; 初步探讨在糖尿病发展过程中胰岛素和血糖对 Aβ42 的影响，并分析糖尿病发展成为认知障碍的风险。方法 腹腔注射链脲佐菌素( streptozotocin，STZ) 复制实验性糖尿病大鼠模型，以血糖浓度≥16. 7 mmol·L－ 1确定模型成立。实验分为正常组与模型组。建模前后共采集5 次血液，每次间隔 15 d。建模 60 d，代谢笼测大鼠 24 h 食量、水量、尿量和粪便量; 建模 70 d，八臂迷宫实验测定大鼠觅食时间、参考记忆错误次数和工作记忆错误次数。用葡萄糖氧化酶法和酶联**吸附法测血糖、胰岛素和 Aβ42 的含量。结果 STZ 复制的糖尿病大鼠模型稳定。模型组大鼠食量、水量、尿量和粪便量明显高于对照组( P ＜0. 01) ; 八臂迷宫实验: 与对照组比较，模型组大鼠觅食时间、参考记忆错误频率和平均探究时间均有显著性差异( P ＜0. 05) ，工作记忆错误频率高于对照组，但是无统计学意义。模型成立初期 Aβ42 随胰岛素增多而降低，建模 45 d，Aβ42 含量*高，之后下降。结论 建模70 d，模型组大鼠学习记忆能力明显低于对照组，糖尿病大鼠患认知障碍的风险明显增高; 糖尿病初期，模型成立 45 ～ 75 d，为给予**干预**的*佳时期; 临床上可以通过同时检测胰岛素和 Aβ42 判断糖尿病是否向认知障碍发展。
关键词: 糖尿病; β-淀粉样蛋白 42; 胰岛素; 血糖; 认知障碍; 动态变化
近年来，糖尿病的发生率正以惊人的速度上升。根据世界卫生组织( WHO) 报道，2006 年全世界约有 1. 8 亿人患糖尿病，2007 年糖尿病患者人数增长到 2. 46 亿，如不进行干预，这一数字到2030 年可能会增加一倍以上。目前我国糖尿病患病人数已经超过 7000 万，成为继肿瘤、心血管病之后的第三大严重威胁人们健康的慢性**。然而，全球超过 20 万人患有老年痴呆症，到2040 年这一数字预计将超过 80 万。*近的一些证据表明，糖尿病和阿尔茨海默氏病( AD) 间有密切的关系。糖尿病被认为是患老年痴呆症包括阿尔茨海默氏病的一个危险因素。然而，这一风险的分子机制还不是很清楚。*近的几项研究结果表明，胰岛素和葡萄糖代谢紊乱增加患痴呆症的风险，特别是在 AD 患者中。脑脊液( cerebrospinal fluid，CSF) 中 β-淀 粉 样 蛋 白( amyloid beta，Aβ) 的水平检测对诊断 AD 的价值已被广泛证实，其诊断 AD 的准确率可达 80% ～90%。Aβ 的聚集和沉积在 AD 的发病过程中具有重要作用，并且 Aβ42 是聚集和沉积的核心。一些证据表明，胰岛素和 Aβ 同时竞争胰岛素降解酶( insulin degrading enzyme，IDE) ，并且 IDE 通过其他多肽底物优先结合胰岛素;另一方面，胰岛素和影响胰岛素水平的因素可能循环调解 Aβ 水平，并且 Aβ42 是 Aβ 聚集的核心。在临床上，被诊断为 AD 患者的病程是不可逆的，无法**，并且在发生 AD 的过程中首先出现认知功能下降，发生认知障碍是共性。因此，早期识别促进 AD 患者发病的病理，对降低 AD 的发展率是必要的。新进研究报道，糖尿病发生时，血糖和胰岛素代谢紊乱，促进 AD 的发生，但是在糖尿病发展到什么程度才能促进 AD 发生的连续研究至今未见报道。因此作者在本实验中选择糖尿病大鼠作为研究对象，观察在糖尿病发展成为认知障碍整个过程中相关生物标记物的动态变化，希望在糖尿病早期的发展过程中，通过监测血液中相关生物标记物的变化及其相关性来检测糖尿病大鼠患认知障碍的风险，并确定*佳**时期。
1 仪器和材料
XR-XB102 八臂迷宫( 上海尊龙凯时人生就是博信息科技有限公司) ，ＲT-6000 酶标仪( 深圳雷杜生命科学股份有限公司) ，LDZ5-2 低速自动平衡离心机( 北京医用离心机厂) ，UV-2102C 紫外分光光度计( 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司) ，FA1004 分析天平( 上海越平科学仪器有限公司) ，微量移液器( 美国 METTLEＲ TOLEDO 公司) ，DGG-9140B 电热恒温古风干燥箱( 上海森信实验仪器有限公司) 。链脲佐菌素( 美国 Sigma 公司，批号 S0130) ，葡萄糖测定试剂盒( 长春汇力生物科技有限公司，批号 20120908) ，Aβ42 酶联**试剂盒( 批号20120826 ) 、胰 岛 素 酶 联 免 疫 试 剂 盒 ( 批 号20120922) ( 上海蓝基( BG) 生物科技有限公司) 。Wistar 大鼠，雄性，30 只，体质量 ( 200 ±20) g，清洁级，购自维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号 SCXK( 京) 2012-0001。
2 方法
2. 1 糖尿病大鼠模型的复制
筛选空腹血糖正常的健康雄性 Wistar 大鼠20 只，禁食不禁水 16 h，以 62 mg·kg－ 1的剂量1 次性腹腔注射质量分数 1% 链脲佐菌素柠檬酸 － 柠 檬 酸 钠 缓 冲 液 ( pH 值 为 4. 5，用0. 1 mol·L－ 1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在冰浴中新鲜配制) ，72 h 后测定静脉血糖浓度，以随机血糖浓度≥16. 7 mmol·L－ 1确定为糖尿病模型。
2. 2 分组
将大鼠按成模前体质量、血糖水平随机分为对照组( n = 10) 和模型组( n = 10) 。常规饲料喂养，自由饮水。
2. 3 动物血浆的制备
采用大鼠眼底静脉丛取血，建模前采集血液1 次，建模后除*后一次间隔 30 d 外其他每间隔15 d 采集，共采集 5 次，3 000 r·min－ 1离心10 min，吸取上清，－ 80 ℃ 保存，待测。
2. 4 血糖、胰岛素和 Aβ42 的测定
血糖采用葡萄糖氧化酶法，用紫外分光光度计测定。胰岛素和 Aβ42 采用 BG 公司胰岛素和Aβ42 酶联**试剂盒测定，用标准品绘制标准曲线。
2. 5 八臂迷宫实验
动物适应实验环境 2 d 后，称质量，连续训练14 d，训练结束后限制性给予正常饲料。据体质量不同，给予大鼠 16 ～ 20 g 饲料，使体质量保持在正常进食大鼠的 80% ～ 85%。第 15 天测定，记录以下 4 个指标: 工作记忆错误次数( workingmemory errors) ，用来评价短期记忆; 参考记忆错误次数( reference memory errors ) ，用来评价长期记忆; 总的入臂次数及测试时间，用来评价大鼠运动量。
2. 6 统计学处理
所有数据均以珋x ± s 表示，用 SPSS 16. 0 统计软件进行单因素方差分析; 组间采用 t 检验，P ＜0. 05 有显著性差异，P ＜ 0. 01 有非常显著性差异。糖尿病发展过程中大鼠血浆主要生物标记物的动态变化。
3 结果
3. 1 体质量的动态变化
建模成功后，正常饲料喂养糖尿病大鼠，糖尿病大鼠体质量下降。动态监测大鼠体质量，糖尿病大鼠与对照组比较有非常显著性差异( P ＜0. 01) 。结果见表 1。
3. 2 一般指标的测定
建模 60 d 后，以每 100 g 大鼠每天代谢量为标准。代谢笼实验结果显示，糖尿病大鼠食量、水量、尿量和粪便量明显高于对照组，差异有显著性( P ＜0.01) ，表明建模60 d 模型稳定。结果见表2。
3. 3 八臂迷宫实验
建模70 d，八臂迷宫实验结果显示，糖尿病大鼠觅食时间、参考记忆错误频率和平均探究时间明显高于对照组，并有显著性差异( P ＜0. 05) ; 工作记忆错误频率高于对照组，但是无统计学意义。结果见表 3。
3. 4 血糖的动态变化
在糖尿病发展过程中，持续检测血糖水平，模型组血糖明显高于对照组，并有非常显著性差异( P ＜0. 01) ，说明糖尿病大鼠模型稳定。糖尿病发展过程中大鼠血浆主要生物标记物的动态变化
3. 5 大鼠血浆中胰岛素和胰岛素抵抗指数的动态变化
成模 0 ～30 d，血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数持续性升高，说明糖尿病大鼠处于胰岛素抵抗阶段; 成模 30 ～45 d，血糖下降，胰岛素和胰岛素抵抗指数继续升高，糖尿病大鼠仍然处于胰岛素抵抗阶段; 成模 45 ～ 75 d，血糖显著性升高，胰岛素生成减少，胰岛素抵抗指数明显下降，并且胰岛素生成量低于 0 点。结果见图 2、3。3. 6 Aβ42 的动态变化成模 15 d，模型组血糖和胰岛素水平增高，Aβ42 水平降低; 15 ～ 45 d，胰岛素和 Aβ42 水平均升高; 45 ～75 d，胰岛素和 Aβ42 水平均降低。结果见图 4。
a． STZ 选择性损伤分泌胰岛素的胰岛 β 细胞，选用 STZ 建立糖尿病大鼠模型稳定，操作简单，实验动物无创伤，成模后易护理。
b． 在建模第 60 天，进行代谢笼实验，测定饮食量、饮水量、尿量和粪便量。统计发现，模型组与对照组比较有显著性差异，说明模型稳定。建模每隔 15 d 测模型组大鼠血糖，与对照组比较均有显著性差异。研究表明，持续高血糖可导致认知功能障碍。长期慢性的高血糖可显著产生“糖毒性”，从而诱导产生淀粉样蛋白、糖基化产物、活性氧等有害物质，损伤神经元细胞，进而导致认知功能障碍。
c． 建模 70 d 进行八臂迷宫试验。实验数据显示，与对照组比较，模型组大鼠觅食时间、参考记忆错误频率和平均探究时间均有显著性差异;工作记忆错误频率高于对照组，但是无统计学意义。说明模型组大鼠与对照组大鼠短期记忆无差异，而长期记忆有差异，并且模型组大鼠运动活性降低。证实糖尿病大鼠学习记忆功能出现障碍。同时还观察到模型组大鼠多出现精神不振、萎靡和反应迟钝等现象。
d． 糖尿病大鼠成模 0 ～ 15 d，血糖和胰岛素含量增多，胰岛素抵抗指数增高，Aβ42 水平降低，与对照组比较均有显著性差异，属于胰岛素抵抗阶段。可能是由于 IDE 生成量随着胰岛素的增多代偿性增多，此时处于胰岛素抵抗初期，并且 IDE可以降解 Aβ42，所以 Aβ42 随着 IDE 的生成增多而减少。成模15 ～45 d，血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数水平继续增高，Aβ42 含量增多。虽然 IDE随着胰岛素的增多代偿性增多，但由于 IDE 优先选择胰岛素，且生成量有限，因此血中 Aβ42 随胰岛素的增多而增多，并且变化幅度大于胰岛素。成模45 ～75 d，血糖升高，胰岛素和胰岛素抵抗指数降低，此期间胰岛素生成量降低，属于原发性胰岛素生成减少，IDE 随着胰岛素的降低负反馈生成减少，Aβ42 降解减少，含量理应不变或增多，但血中 Aβ42 水平降低，说明此时血中 Aβ42 出现沉积。结合八臂迷宫实验，糖尿病大鼠在 70 d 出现学习记忆能力下降，精神萎靡，说明在造模 70 d时糖尿病大鼠脑内出现实质性的变化，结合 Aβ42在 45 ～ 75 d 水平下降、出现沉积推测，糖尿病大鼠的学习记忆能力与 Aβ42 出现沉积有关，而对照组没有显著性变化，因此糖尿病大鼠患认知障碍的风险明显高于对照组。
e． 研究结果表明，糖尿病成模 45 d 时，大鼠血浆中胰岛素和 Aβ42 水平达到*高峰，之后水平下降，并且在 70 d 时出现认知功能障碍，推测此时 Aβ42 出现沉积。无论胰岛素增多还是减少都影响 Aβ42 的水平。因此糖尿病向认知转变的关键时期是糖尿病成模45 ～75 d。单一指标不能有效说明认知问题，临床没有八臂迷宫，所以临床需结合认知评价量表和观察病人状态同时监测血中胰岛素和 Aβ42 变化判断糖尿病是否向认知障碍发展—认知出现障碍，精神不振、萎靡、反应迟钝，并出现胰岛素和 Aβ42 水平急剧下降。在糖尿病初期( 大鼠成模 45 ～75 d 时) 给予干预**，是防止糖尿病向认知障碍发展的*好时机，从而抑制糖尿病向认知障碍发展。