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黄连**汤对衰老小鼠学习记忆自发活动的影响

摘要 目的:探讨黄连**汤对衰老小鼠的抗衰老作用及其机制。方法:采用皮下注射D-半乳糖的方法制备衰老小鼠模型。将ICR小鼠随机分为正常对照组、模型组、1、2、4和8g/kg黄连**汤生药量处理组,采用自发活动实验检测小鼠的自主活动,用跳台实验检测小鼠的学习记忆能力,用硫代***酸法和黄嘌呤氧化酶法测定脑组 织 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD)和 丙 二 醛(MDA)含量。结果:与正常对照组相比,模型组小鼠的学习记忆能力减退,MDA含量增加,SOD活性降低。黄连**汤各剂量组小鼠的学习记忆能力明显改善,与1g/kg和8g/kg相比,2g/kg和4g/kg黄连**汤组小鼠脑内的MDA含量明显降低,SOD活性显著增高。结论:黄连**汤能显著改善D-半乳糖衰老小鼠学习记忆能力,其机制可能与其抗氧化特性有关。黄连**汤对衰老小鼠学习记忆自发活动的影响。
关键词  黄连**汤;D-半乳糖;衰老;抗氧化
衰老是由多种复杂因素相互作用引起的生物学过程,是生命周期中按一定规律发生在机体、器官、组织细胞的形态和功能的演变过程。在动物衰老模型中,由中国学者提出的利用大剂量D-半乳糖造成动物的糖代谢障碍,进而影响蛋白质代谢和脂类代谢,致使动物组织、细胞出现一系列退行性变化,较为符合人类自然衰老时所出现的症状。
黄连**汤(huanglian-jian-du-tang,HJDT)出自《外台秘要》,由黄连、黄芩、黄柏和栀子4味生药组成,为清热**的经典方剂。近年来,国内外医药学界对HJDT的现代药理学研究中,应用了大量的实验方法和动物模型对其进行了多方面的研究。结果表明,HJDT具有保护肝损伤及改善脑缺血等作用,在对APP/PS1双转基因阿尔茨海默病(AD)小鼠的研究中,发现HJDT可能通过提高抗氧化能力,对AD小鼠海马神经细胞起到保护作用。但是,HJDT对D-半乳糖致衰老小鼠的作用尚未见报道。本实验通过D-半乳糖致衰老模型,观察HJDT对亚急性衰老小鼠的行为学以及脑组织中的超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的影响,进一步为黄连**汤预防衰老作用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂  D-半乳糖购自amresco公司(批号:2032C149)。黄连**汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子按3∶3∶2∶3比例混合,药材购自浙江省华东医药股份有限公司并经鉴定,加水浸泡1h,水煎2次,煎液浓缩至生药含量为2g/mL,pH 7.0。考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、SOD(批号:20121228)、MDA(批号:20121231)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
    1.2 动物与分组
ICR小鼠90只,雌雄各半,体重23~27g,由上海斯莱克实验动物有限公司提供[实验动物合格证:SCXK(沪)2007-0005]。所有的动物实验均遵照国家实验动物饲养管理和使用指南,动物饲养在温度控制的环境(22±2)℃下,12h明暗循环,自由饮食和饮水。动物随机分为正常对照组、衰老模型组、HJDT 1、2、4和8g/kg组,每组15只。小鼠在实验室适应1周后,采取颈背部皮下注射的方法,衰老模型组及各给药组给予D-半乳糖溶液150mg/kg,正常对照组给予等量生理盐水,每日1次,连续12周。其中后6周,HJDT各组增加灌胃给予HJDT 1、2、4和8g/kg。正常对照组和衰老模型组增加灌胃给予同等量生理盐水,每日1次。
    1.3 开场自发活动实验
 实验当天,先将小鼠放到自发活动实验室适应环境1h。将小鼠头朝前轻轻放入活动箱中央,关上箱门,拍摄记录自发活动1h。实验结束后,采用小鼠自发活动计算机图像分析系统,提取活动轨迹及小鼠在开场各区域的活动路程、停留次数、停留时间等指标。
1.4 跳台试验
      小鼠跳台试验反射箱由不透明有机玻璃分隔为5间,箱底为铜栅,通以36V电流,每间设置一高为3.0cm、直径为3.2cm橡皮垫作为动物回避电击的**区。实验时,将小鼠置于箱中,自由活动5min,然后将其置于**台上,箱底通电,观察其跳台的潜伏期(latency,L)并记录5min内小鼠跳下台的次数,即错误次数(mistake,M),此为训练成绩,24h后再测为测试成绩。
1.5 SOD和MDA等生化指标含量测定
 小鼠脑组织用滤纸拭干后,精密称重并尽快剪碎与冷生理盐水按体积比1∶9混合,用匀浆器打匀后离心10min,分离出上清液即得10%的组织匀浆,按照试剂盒说明书方法测定MDA含量(硫代***酸法)。将10%组织匀浆稀释10倍后按照试剂盒说明书方法分别测定SOD活性(黄嘌呤氧化酶法)和蛋白含量(考马斯亮蓝显色法)。黄连**汤对衰老小鼠学习记忆自发活动的影响
1.6 统计学处理
 实验数据以均数±标准差(x±s)表示,多组均数间比较采用One-ANOVA检验,两两比较采用Newman-Keuls法。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HJDT对衰老小鼠自发活动的影响  与正常对照组相比,衰老模型组在总路程、中央路程和中央时间有减小的趋势,但无统计学意义(表1,P>0.05)。HJDT各剂量组与衰老模型组相比也均无统计学差异(表1,P>0.05)
    2.2 HJDT对衰老小鼠脑组织SOD、MDA含量的影响  与正常对照组相比,模型组脑组织SOD含量明显降低,而MDA含量显著升高(图1~2,P<0.01)。与衰老模型组相比,HJDT 2、4g/kg组脑组织SOD含量显著提高(图1,P<0.05)、HJDT 2、4、8g/kg组MDA含量显著降低(图2,P<0.05)。
2.3 HJDT对衰老小鼠跳台试验的影响  与正常对照组相比,模型组在跳台试验的测试中,潜伏期明显缩短,错误次数显著增加(图3~4,P<0.01)。而HJDT 1、2、4g/kg能明显延长潜伏期(图3,P<0.05),1、2、4、8g/kg减少错误次数(图4,P<0.01)。
3 讨论
衰老是生命进程中不可避免的生理功能的退化过程,这个过程包括认知功能障碍、神经功能障碍等方面,在较短时间内连续给动物注射大剂量的D-半乳糖,在半乳糖氧化酶的作用下可以转变成醛糖和氢过氧化物,从而导致过氧化物阴离子和氧自由基的大量生成和堆积,影响正常渗透压,引起细胞肿胀、功能障碍、代谢紊乱,导致神经元线粒体结构损伤,学习记忆能力显著下降,引起衰老。而脑衰老的特征表现为认知功能和活动能力等方面的行为缺陷,这与氧化损伤和炎症密切相关,氧化性损伤成为衰老和其他与衰老相关的如AD、帕金森病(PD)等**的关键。SOD是体内重要的抗氧化酶,可以通过歧化作用**超氧阴离子自由基,从而保护机体的细胞和组织,延缓衰老过程。但随着年龄的增长,机体**自由 基 的 能 力 下 降,产 生 大 量 代 谢 产 物 如MDA,MDA会通过降低膜的流动性以及改变膜结合蛋白的结构和功能引起细胞膜的损伤,进而加速机体衰老。因此SOD含量的高低可以间接反映机体**自由基的能力,而MDA含量的高低可以间接反映细胞的衰老程度。
近年来在**神经性损伤方面的大量研究表明,HJDT在脑缺血、脑缺氧模型中可降低大鼠脑、肝、胰组织的MDA含量,抑制过氧化脂质的生成及消除氧自由基作用。能促进脑缺血动物学习记忆行为,其作用机制可能与减少脑中自由基终产物MDA含量、增加大脑皮质和海马组织脑血流量有关。在AD大鼠模型中,黄连**汤可以调整其**功能和增加**能力。本实验结果显示,HJDT可以增加由D-半乳糖引起的衰老小鼠的SOD活性,减少MDA的产生。在行为学方面,模型组和HJDT各组对自发活动中总路程、中央区的活动路程以及中央区活动时间无显著影响,但在跳台试验中,HJDT能够延长跳台实验中的潜伏期,减少错误次数,相对于模型组,表现为学习记忆能力有所提高。提示其作用机制可能与其增强对氧自由基的**作用,减少体内氧自由基的产生,改善D-半乳糖引起的氧化应激损伤,防止细胞内Ca2+超载从而起到抗氧化,抗衰老的作用有关,其具体机制还有待于进一步的研 究。从 药 物 的 剂 量 上 看,以2g/kg和4g/kg剂 量 的HJDT的 效 果 较 为 明 显,而8g/kg的剂量在SOD含量及跳台试验中均作用不大。
综上所述,中等剂量的HJDT能通过提高脑组织SOD活性和降低MDA含量,能有效地改善D-半乳糖衰老小鼠学习和记忆能力。