摘要 目的：探讨黄连**汤对衰老小鼠的抗衰老作用及其机制。方法：采用皮下注射Ｄ－半乳糖的方法制备衰老小鼠模型。将ＩＣＲ小鼠随机分为正常对照组、模型组、１、２、４和８ｇ／ｋｇ黄连**汤生药量处理组，采用自发活动实验检测小鼠的自主活动，用跳台实验检测小鼠的学习记忆能力，用硫代***酸法和黄嘌呤氧化酶法测定脑组 织 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 （ＳＯＤ）和 丙 二 醛（ＭＤＡ）含量。结果：与正常对照组相比，模型组小鼠的学习记忆能力减退，ＭＤＡ含量增加，ＳＯＤ活性降低。黄连**汤各剂量组小鼠的学习记忆能力明显改善，与１ｇ／ｋｇ和８ｇ／ｋｇ相比，２ｇ／ｋｇ和４ｇ／ｋｇ黄连**汤组小鼠脑内的ＭＤＡ含量明显降低，ＳＯＤ活性显著增高。结论：黄连**汤能显著改善Ｄ－半乳糖衰老小鼠学习记忆能力，其机制可能与其抗氧化特性有关。黄连**汤对衰老小鼠学习记忆自发活动的影响。
关键词 黄连**汤；Ｄ－半乳糖；衰老；抗氧化
衰老是由多种复杂因素相互作用引起的生物学过程，是生命周期中按一定规律发生在机体、器官、组织细胞的形态和功能的演变过程。在动物衰老模型中，由中国学者提出的利用大剂量Ｄ－半乳糖造成动物的糖代谢障碍，进而影响蛋白质代谢和脂类代谢，致使动物组织、细胞出现一系列退行性变化，较为符合人类自然衰老时所出现的症状。
黄连**汤（ｈｕａｎｇｌｉａｎ－ｊｉａｎ－ｄｕ－ｔａｎｇ，ＨＪＤＴ）出自《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏和栀子４味生药组成，为清热**的经典方剂。近年来，国内外医药学界对ＨＪＤＴ的现代药理学研究中，应用了大量的实验方法和动物模型对其进行了多方面的研究。结果表明，ＨＪＤＴ具有保护肝损伤及改善脑缺血等作用，在对ＡＰＰ／ＰＳ１双转基因阿尔茨海默病（ＡＤ）小鼠的研究中，发现ＨＪＤＴ可能通过提高抗氧化能力，对ＡＤ小鼠海马神经细胞起到保护作用。但是，ＨＪＤＴ对Ｄ－半乳糖致衰老小鼠的作用尚未见报道。本实验通过Ｄ－半乳糖致衰老模型，观察ＨＪＤＴ对亚急性衰老小鼠的行为学以及脑组织中的超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和丙二醛（ＭＤＡ）含量的影响，进一步为黄连**汤预防衰老作用提供科学依据。
１ 材料与方法
１．１ 药品与试剂 Ｄ－半乳糖购自ａｍｒｅｓｃｏ公司（批号：２０３２Ｃ１４９）。黄连**汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子按３∶３∶２∶３比例混合，药材购自浙江省华东医药股份有限公司并经鉴定，加水浸泡１ｈ，水煎２次，煎液浓缩至生药含量为２ｇ／ｍＬ，ｐＨ ７．０。考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、ＳＯＤ（批号：２０１２１２２８）、ＭＤＡ（批号：２０１２１２３１）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
１．２ 动物与分组
ＩＣＲ小鼠９０只，雌雄各半，体重２３～２７ｇ，由上海斯莱克实验动物有限公司提供［实验动物合格证：ＳＣＸＫ（沪）２００７－０００５］。所有的动物实验均遵照国家实验动物饲养管理和使用指南，动物饲养在温度控制的环境（２２±２）℃下，１２ｈ明暗循环，自由饮食和饮水。动物随机分为正常对照组、衰老模型组、ＨＪＤＴ １、２、４和８ｇ／ｋｇ组，每组１５只。小鼠在实验室适应１周后，采取颈背部皮下注射的方法，衰老模型组及各给药组给予Ｄ－半乳糖溶液１５０ｍｇ／ｋｇ，正常对照组给予等量生理盐水，每日１次，连续１２周。其中后６周，ＨＪＤＴ各组增加灌胃给予ＨＪＤＴ １、２、４和８ｇ／ｋｇ。正常对照组和衰老模型组增加灌胃给予同等量生理盐水，每日１次。
实验当天，先将小鼠放到自发活动实验室适应环境１ｈ。将小鼠头朝前轻轻放入活动箱中央，关上箱门，拍摄记录自发活动１ｈ。实验结束后，采用小鼠自发活动计算机图像分析系统，提取活动轨迹及小鼠在开场各区域的活动路程、停留次数、停留时间等指标。
１．４ 跳台试验
小鼠跳台试验反射箱由不透明有机玻璃分隔为５间，箱底为铜栅，通以３６Ｖ电流，每间设置一高为３．０ｃｍ、直径为３．２ｃｍ橡皮垫作为动物回避电击的**区。实验时，将小鼠置于箱中，自由活动５ｍｉｎ，然后将其置于**台上，箱底通电，观察其跳台的潜伏期（ｌａｔｅｎｃｙ，Ｌ）并记录５ｍｉｎ内小鼠跳下台的次数，即错误次数（ｍｉｓｔａｋｅ，Ｍ），此为训练成绩，２４ｈ后再测为测试成绩。
１．５ ＳＯＤ和ＭＤＡ等生化指标含量测定
小鼠脑组织用滤纸拭干后，精密称重并尽快剪碎与冷生理盐水按体积比１∶９混合，用匀浆器打匀后离心１０ｍｉｎ，分离出上清液即得１０％的组织匀浆，按照试剂盒说明书方法测定ＭＤＡ含量（硫代***酸法）。将１０％组织匀浆稀释１０倍后按照试剂盒说明书方法分别测定ＳＯＤ活性（黄嘌呤氧化酶法）和蛋白含量（考马斯亮蓝显色法）。黄连**汤对衰老小鼠学习记忆自发活动的影响
１．６ 统计学处理
实验数据以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，多组均数间比较采用Ｏｎｅ－ＡＮＯＶＡ检验，两两比较采用Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌｓ法。Ｐ＜０．０５表示差异有统计学意义。
２ 结果
２．１ ＨＪＤＴ对衰老小鼠自发活动的影响 与正常对照组相比，衰老模型组在总路程、中央路程和中央时间有减小的趋势，但无统计学意义（表１，Ｐ＞０．０５）。ＨＪＤＴ各剂量组与衰老模型组相比也均无统计学差异（表１，Ｐ＞０．０５）
２．２ ＨＪＤＴ对衰老小鼠脑组织ＳＯＤ、ＭＤＡ含量的影响 与正常对照组相比，模型组脑组织ＳＯＤ含量明显降低，而ＭＤＡ含量显著升高（图１～２，Ｐ＜０．０１）。与衰老模型组相比，ＨＪＤＴ ２、４ｇ／ｋｇ组脑组织ＳＯＤ含量显著提高（图１，Ｐ＜０．０５）、ＨＪＤＴ ２、４、８ｇ／ｋｇ组ＭＤＡ含量显著降低（图２，Ｐ＜０．０５）。
２．３ ＨＪＤＴ对衰老小鼠跳台试验的影响 与正常对照组相比，模型组在跳台试验的测试中，潜伏期明显缩短，错误次数显著增加（图３～４，Ｐ＜０．０１）。而ＨＪＤＴ １、２、４ｇ／ｋｇ能明显延长潜伏期（图３，Ｐ＜０．０５），１、２、４、８ｇ／ｋｇ减少错误次数（图４，Ｐ＜０．０１）。
３ 讨论
衰老是生命进程中不可避免的生理功能的退化过程，这个过程包括认知功能障碍、神经功能障碍等方面，在较短时间内连续给动物注射大剂量的Ｄ－半乳糖，在半乳糖氧化酶的作用下可以转变成醛糖和氢过氧化物，从而导致过氧化物阴离子和氧自由基的大量生成和堆积，影响正常渗透压，引起细胞肿胀、功能障碍、代谢紊乱，导致神经元线粒体结构损伤，学习记忆能力显著下降，引起衰老。而脑衰老的特征表现为认知功能和活动能力等方面的行为缺陷，这与氧化损伤和炎症密切相关，氧化性损伤成为衰老和其他与衰老相关的如ＡＤ、帕金森病（ＰＤ）等**的关键。ＳＯＤ是体内重要的抗氧化酶，可以通过歧化作用**超氧阴离子自由基，从而保护机体的细胞和组织，延缓衰老过程。但随着年龄的增长，机体**自由 基 的 能 力 下 降，产 生 大 量 代 谢 产 物 如ＭＤＡ，ＭＤＡ会通过降低膜的流动性以及改变膜结合蛋白的结构和功能引起细胞膜的损伤，进而加速机体衰老。因此ＳＯＤ含量的高低可以间接反映机体**自由基的能力，而ＭＤＡ含量的高低可以间接反映细胞的衰老程度。
近年来在**神经性损伤方面的大量研究表明，ＨＪＤＴ在脑缺血、脑缺氧模型中可降低大鼠脑、肝、胰组织的ＭＤＡ含量，抑制过氧化脂质的生成及消除氧自由基作用。能促进脑缺血动物学习记忆行为，其作用机制可能与减少脑中自由基终产物ＭＤＡ含量、增加大脑皮质和海马组织脑血流量有关。在ＡＤ大鼠模型中，黄连**汤可以调整其**功能和增加**能力。本实验结果显示，ＨＪＤＴ可以增加由Ｄ－半乳糖引起的衰老小鼠的ＳＯＤ活性，减少ＭＤＡ的产生。在行为学方面，模型组和ＨＪＤＴ各组对自发活动中总路程、中央区的活动路程以及中央区活动时间无显著影响，但在跳台试验中，ＨＪＤＴ能够延长跳台实验中的潜伏期，减少错误次数，相对于模型组，表现为学习记忆能力有所提高。提示其作用机制可能与其增强对氧自由基的**作用，减少体内氧自由基的产生，改善Ｄ－半乳糖引起的氧化应激损伤，防止细胞内Ｃａ２＋超载从而起到抗氧化，抗衰老的作用有关，其具体机制还有待于进一步的研 究。从 药 物 的 剂 量 上 看，以２ｇ／ｋｇ和４ｇ／ｋｇ剂 量 的ＨＪＤＴ的 效 果 较 为 明 显，而８ｇ／ｋｇ的剂量在ＳＯＤ含量及跳台试验中均作用不大。
综上所述，中等剂量的ＨＪＤＴ能通过提高脑组织ＳＯＤ活性和降低ＭＤＡ含量，能有效地改善Ｄ－半乳糖衰老小鼠学习和记忆能力。