摘要 目的：观察 Tg-SwDI/B 小鼠空间记忆能力与脑内 β 淀粉样(Aβ)蛋白分布的情况。方法：12 月龄纯合子 Tg-SwDI/B 小鼠和野生型 C57BL/6 各 20 只，雌雄比例为 1∶1；通过八臂迷宫检测小鼠的空间记忆能力，硫磺素 -S 染色和 GFAP **荧光染色显示 Aβ 及星形胶质细胞在小鼠脑内的分布特点。结果：Tg-SwDI/B 小鼠空间记忆功能明显受损，表现为长期记忆功能下降，脑内有大量纤维化 Aβ 沉积在血管或其周围，并且可见 GFAP 阳性星形胶质细胞，两者均在海马和丘脑区域更为多见。同月龄野生型小鼠脑内未见纤维化 Aβ 沉积，存在少量 GFAP 阳性星形胶质细胞，但数量明显少于Tg-SwDI/B 小鼠。结论：Tg-SwDI/B 小鼠的空间记忆功能受损，可能与海马区域血管相关性纤维化Aβ 和活化的星形胶质细胞增生相关。
关键词 Tg-SwDI/B 小鼠；八臂迷宫；纤维化；星形胶质细胞；空间记忆受损
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年痴呆常见的原因之一，主要表现为认知功能下降；脑淀粉样血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)的主要临床表现为脑叶出血，部分患者也有痴呆表现。AD 和 CAA 的共同病理特点是脑血管中有 β 淀粉样(amyloidβ，Aβ)蛋白沉积。脑血管中沉积的 Aβ 大部分呈纤维化，与认知功能受损相关。Tg-Sw-
DI/B 转基因小鼠表达突变的人型 APP基因，可用于研究 AD 和 CAA 的发病机 制 和 治 疗 方 法 。 本 课 题 组 即 对Tg-SwDI/B 小鼠的空间记忆功能和脑内 Aβ 分布情况进行研究。八臂迷宫与小鼠空间记忆能力的研究探讨
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 纯合子 Tg-SwDI/B小鼠购自美国 Jackson 实验室，该小鼠表达瑞典型 (Swedish K670N/M671L)、荷兰型 (Dutch E693Q) 及爱荷华州型(Iowa D694N)3 种突变的人型 APP 基因。12 月龄纯合子 Tg-SwDI/B 小鼠与同月龄野生型 C57BL/6 小鼠各 20 只，
雌雄比例为 1∶1，用于实验。
1.1.2 主要试剂与材料 硫磺素 -S 购于 Sigma 公司，胶质纤维酸性蛋白(glia fibril-lary acidic protein，GFAP)兔抗小鼠多克隆抗体购于 Santa Cruz 公司，collagen IV 兔抗小鼠多克隆抗体购于 Abcam 公司，花青素 3(Cyanine3，Cy3) 标记的山羊抗兔二抗购于 Proteintech
公司；荧光显微镜(LX51)购于 OLYMPUS 公司。
1.2 方法
1.2.1 八臂迷宫 动物适应实验环境 1 周后称重，实验前禁食 24 h。每天训练结束后限制性给予正常食料(2~3 g)，以使体重保持在正常进食小鼠的 80%~85%。自由摄食训练：在迷宫各臂及中央分撒食物颗粒 (直径约 3~4 mm)，同时将 4 只小鼠置于迷宫中央，让其自由摄食10 min，训练 2 d；在每个臂靠近末端放 1 颗食粒，让单只小鼠自由摄食，吃完或 10 min 后将其取出，训练 2 d。测试训练：随机选 4 个臂末端各放 1 颗食粒，将小鼠放在迷宫中央，30 s后臂门打开，让其在迷宫中自由摄食，吃完或10 min 后将小鼠取出，连续训练 10 d。记录以下指标：①工作记忆错误(working memory er-rors)，即在同一次训练中动物再次进入已经吃过食粒的臂：代表短期记忆；②参考记忆错误(reference memory errors)，即动物进入不曾放过食粒的臂：代表长期记忆。
1.2.2 组织学染色 常规漂片法制作脑组织冰冻切片，片厚 20μm。①硫磺素 -S 染色：贴片法，经过 100%、95%、80%及 70%酒精梯度至水，1%硫磺素 -S 染色 15 min，酒精梯度脱水，二甲苯透明，封片。②**荧光染色：含 0.3%Triton的山羊血清封闭 30min，加入 collagenIV 一抗(1∶400 稀释)或 GFAP 一抗(1∶100 稀释)，4 ℃孵育过夜，PBS 洗，5min×2 次，加入二抗(1∶100 稀释)室温孵育 2h，PBS洗，5min×2 次，封片。
1.2.3 形态学计量分析 每只小鼠选取相同部位 GFAP 染色切片 10 张，每张切片对海马、丘脑及皮质随机测量 4 个视野，取平均值。所有视野放大 400 倍，通过 Image Pro Plus6.0 图像分析软件计算 GFAP 阳性星形胶质细胞密度。
1.3 统计分析
采用SPSS17.0软件处理数据，计量资料以(x±s)表示，八臂迷宫实验结果采用重复测量方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 八臂迷宫结果
Tg-SwDI/B 小鼠参考记忆错误次数明显多于野生型小鼠，从训练第 5 天开始差异具有统计学意义(P<0.05)；工作记忆错误次数 2 种小鼠差异无统计学意义。
2.2 小鼠脑组织冰冻切片染色结果
2.2.1 硫磺素 -S 及 collagen IV 染色结果八臂迷宫与小鼠空间记忆能力的研究探讨
Tg-SwDI/B 小鼠脑内纤维化 Aβ 主要沿血管分布或聚集在血管周围，多见于海马和丘脑。可见Tg-SwDI/B 小鼠脑内血管有淀粉样病变，而且主要发生在海马和丘脑等微血管丰富的区域。同月龄野生型小鼠脑内未见 Aβ 沉积。
2.2.2 星形胶质细胞染色 Tg-SwDI/B 小鼠全脑均可见 GFAP 阳性星形胶质细胞，高倍镜下活化的星形胶质细胞呈现较多分支突起，密集分布在海马和丘脑区域，在海马齿状回处阳性细胞聚集成团。Tg-SwDI/B 小鼠海马齿状回、海马下托、丘脑及皮质的 GFAP 阳性细胞数分别为 (65.5±4.9)、(39.2±2.8)、(43.3±8.2)及(25.8±2.8)10的3次方个 /mm的3次方，均显著高于野生型小鼠的(38±0.5)、(23.7±3.2)、(6.6±3.8)及(12.3±3.1)10的3次方个 /mm的3次方(均 P<0.001)；Tg-SwDI/B 小鼠海马齿状回区域 GFAP 阳性星形胶质细胞密度*大。
3 讨论
Swedish K670N/M671L 突变基因，位于APP 基因编码的 β 分泌酶酶切位点处，可增强 β 分泌酶水解能力，导致 Aβ 产量增加。Tg-SwDI/B 小鼠保留 Swedish K670N/M671L突变基因，同时引入 Dutch/Iowa 2 个突变基因，产生 Dutch/Iowa 突变 APP，经酶水解后产生 Dutch/Iowa 突变 Aβ 肽。体外研究发现，Dutch/Iowa 突变的 Aβ 在 22 和 23 位点存在负电荷丢失，导致可溶性 Aβ 更容易聚集组装成纤维化 Aβ。且 Dutch/Iowa 突变 Aβ 与LRP-1(脑内** Aβ 的重要受体)的亲和力较野生型 Aβ 低，导致 Aβ **减少，更易滞留在血管周围，产生脑血管淀粉样病理改变。
硫磺素 -S 以及血管标记物 collagen IV 多克隆抗体组织染色结果发现 Tg-SwDI/B 小鼠脑内纤维化 Aβ 主要沉积在血管或其周围，多见于微血管丰富的海马和丘脑区域，提示
Tg-SwDI/B 小鼠脑内血管有明显的淀粉样病变。GFAP **荧光染色显示 Tg-SwDI/B 小鼠脑内可见大量 GFAP 阳性星形胶质细胞，活化的星形胶质细胞呈现较多树枝状突起，海马齿状回处 GFAP 阳性细胞密度*大。同月龄野生型小鼠脑内未见 Aβ 沉积，可观察到 GFAP 阳性星形胶质细胞，但其在各个脑区细胞密度均少于 Tg-SwDI/B 转基因小鼠。综上所述，Tg-SwDI/B 转基因小鼠海马区域既有丰富的纤维化 Aβ 沿血管沉积，又有较多的 GFAP 阳性星形胶质细胞，提示纤维化 Aβ 和活化的星形胶质细胞增生有一定的相关性，此结果与国外文献报道一致。有文献报道，3 月龄时Tg-SwDI/B 转基因小鼠就能在海马下托处出现沿血管沉积的纤维化 Aβ、少量活化的星形胶质细胞和小胶质细胞，随着月龄的增长 Aβ沉积增多，6 月龄时可在嗅球和丘脑区域出现Aβ 沉积和炎症细胞浸润，12 月龄时整个前脑都可见沉积和大量神经炎症细胞。Tg-SwDI/B小鼠较其他转基因 AD 小鼠模型 (如单转Tg2576、双转 APPSwe/PS1 小鼠模型)能更早出现显著的脑血管淀粉样病变。
八臂迷宫实验结果提示 Tg-SwDI/B 小鼠空间记忆能力受损，且表现为长期记忆功能下降。有研究通过巴恩斯迷宫实验证实了 3 月龄的 Tg-SwDI/B 小鼠就表现出空间记忆功能障碍。海马在空间学习与记忆中发挥着重要作用，本研究中发现 Tg-SwDI/B 小鼠海马区域有大量纤维化Aβ沿血管分布，并且存在大量活化的星形胶质细胞，推测纤维化Aβ和活化的星形胶质细胞增生可能影响海马神经元的功能，导致小鼠空间记忆能力受损。研究发现减轻Aβ负荷或****能改善AD小鼠的学习与记忆能力。
综上所述，Tg-SwDI/B 转基因小鼠在行为学上很早即出现明显空间记忆受损，且有早发的脑血管淀粉样病变和活化的星形胶质细胞增生，是研究 AD及 CAA等**的良好动物模型。