众多研究和临床实践表明, 脑内DA 系统与动物的运动、学习、记忆、情绪等活动有密切关系。帕金森病 ( Park in son ’ s d isease, PD ) 就是原因不明的黑质DA 能神经元变性丢失, 导致纹状体内DA 释放量减少, 从而出现僵直、静止性震颤和运动障碍等症状, 并伴有痴呆发生。目前PD 大鼠模型大多以**诱导的旋转实验作为建模成功与否的观察指标, 但此时黑质DA 能神经元丢失80% 左右, 纹状体DA 含量下降超过 90% , 相当于临床PD 晚期。利用开野实验作为行为学观察指标, 动态观察黑质DA 能神经元形态学变化与行为改变之间的关系, 相关报道还不多见。本实验利用 6-O HDA 特异毁损大鼠单侧黑质DA 能神经元, 在不同时间点观察DA 能神经元的病理变化, 丢失比例和行为学改变, 分析两者之间的相关性, 以期为 PD 早期模型提供行为学评价指标, 为 PD 早期病理改变和神经生化研究提供指导。

1　材料与方法

1. 1 　 仪 器 及 主 要 试 剂 　 脑立体定位仪 , 微量推进器  , SuperMaze动物行为图像分析系统  , 旷场实验箱，6-O HDA 、酪氨酸羟化酶 抗体 , SABC、 DAB 。

1. 2 　实验动物及分组　健康 Sp rague2 D aw ley雄性大鼠 60 只 ( 安徽医科大学实验动物中心提供) ,体重 210 ～ 240g , 随机分为正常对照组 ( N C ) ( n =10) , 实验对照组 ( EC ) ( n = 10) , 和实验组 ( n = 40) ,后者按处死时间不同随机分成 4 组, 每组 10 只。

1. 3 　 6-O HDA 毁 损 　 7% 水 合 氯 醛 ( ip ,350 m g/kg ) 麻醉大鼠, 头颅水平位固定在脑立体定位仪上, 门齿沟平面比耳间线平面低2. 4 mm , 剪去头部毛, 切开头皮, 暴露颅骨前囟点 ( 若不清晰, 可用3% H 2 O 2 擦洗) , 参照包新民等

著《大鼠脑立体定位 图 谱》确 定 右 侧 SN c 区 坐 标 前 囟 后 (A P )- 5. 2 mm , 右侧旁开 (R ) 1. 3 mm , 深度 ( V ) 8. 0 mm ,颅骨钻孔后 ( 切勿损伤软脑膜) , 1L l 微量注射器插入右侧SN c 区, 注射8g /L 6-O HDA ( 溶于0. 2% V itC 生理盐水溶液) 1L l, 利用微量推进器缓慢推进 ( 0. 5L l/m in ) 。注射完毕, 留针5 m in 后缓慢拔针, 缝合皮肤并肌注硫酸庆大霉素 ( 5 m g/kg ) 预防感染, 清醒后置笼喂养。 EC 组仅注射0. 2% V itC 生理盐水溶液1L l , N C组不手术。

1. 4 　开场实验 (op en 2 f ield test )

　敞口木箱60cm ×60cm ×40cm , 里面涂成黑色, 箱底划为 25 个方格 ( 12 cm ×12cm ) , 将大鼠放入正中一格, 10 s 后开始记录 15 m in 内各项行为指标。观察指标: ( 1) 旋转行为, 记录左、右侧旋转的圈数, 按公式右侧/( 左侧+ 右侧) 计算不对称指数; ( 2) 探究行为, 鼻子距离箱壁 5cm 以内的跑动时间; ( 3) 穿梭距离, 规定时间内跑动的格子数 ( 二爪以上跨入邻格为跑动一格) ;( 4) 下肢站立, 双上肢抬起离地 1cm 以上的次数; ( 5)修饰次数, 理毛、洗脸、舔舐次数。在毁损术后1d 、 3d 、5d 、 7d 、 14d 、 21d 各观察 1 次, 每次实验均在 7: 00 ～12: 00 AM 进行, 实验室内暗光、安静, 两次实验之间将箱底打扫干净。

1. 5　形态学观察

1. 5. 1 　取材　分别在术后 1d 、 7d 、 14d 、 21d 行为学测试完毕, 7% 水合氯醛 ( ip , 350 m g/Kg) 麻醉大鼠, 置于冰盘上, 打开胸腔, 暴露心脏, 先用 0. 9%N aC l 100 m l 经心脏冲洗, 然后300 m l 4% 多聚甲醛灌注固定, 取出脑组织4% 多聚甲醛后固定24h。在针道旁冠状面切开, 石蜡包埋, 连续切片, 片厚 6L m , 常规H E 染色。定位不在SN c 区的大鼠从该组剔除, 不进行统计学分析。

1. 5. 2　 N issl 染色　切片脱蜡至水, 0. 1% 硫堇冰醋酸水溶液染色15 ～ 20 m in, 95% 酒精快速分色 ( 2～ 3 s 即可) , 脱水、透明、封片、镜检。

1. 5. 3　**组织化学染色 ( ABC 法) 　切片脱蜡至水后经 3% H 2 O 2 灭活内源性过氧化物酶, 微波抗原修复 2 次, 正常山羊血清封闭 20 m in 后, 1 ∶500TH 一抗 4℃冰箱孵育过夜, 滴加生物素化二抗和 SABC 37℃各孵育 20 m in。其间, 各步骤间均用0. 01 mo l/L PBS (pH 7. 2) 充分洗涤, *后加DAB 显色 ( 镜检控制显色时间) , 常规脱水、透明、封片、镜

检。

1. 5. 4　电镜观察　灌注固定后, 分离黑质和纹状体约 1 mm

3, 2. 5% 戊二醛、 1% 锇酸双重固定, 脱水, Epon 812 包埋, L KB- NOVA 切片机超薄切片,醋酸铀枸橼酸铅双重染色, 透射电镜观察。

1. 5. 5 　图像分析　采用江苏捷达图像分析系统对切片进行图像分析, 根据N issl 染色圈出黑质范围, 采用同一放大倍数 ( ×100) , 同一光强度下测量阳性数密度, 并按照公式: 100- ( 右侧细胞数/ 左侧细胞数) ×100, 计算DA 能神经元毁损程度。

1. 5. 6 　统计方法　所有数据采用X ±s 表示,SPSS11. 5 统计软件进行分析, 采用单因素方差分析( ANOVA ) 进行组间比较, *小有意义差异 t 检验( L SD -t) 进行组内两两比较, 开野实验各参数与黑质DA 能神经元毁损比例作 Pear son’ s 相关分析。

2　结　果

2. 1　开场实验结果　 ( 1) 旋转行为: 组间比较差异有显著性 (P < 0. 05) 。在术后 1d 右侧旋转行为增多 ( 与对照组比较P < 0. 05) , 3d 、 5d 恢复到对照组水平 ( P > 0. 05, 与 1d 、 14d 、 21d 组比较 P <0. 05 ) , 而后右侧旋转又逐渐占据优势 ( 14d 、 21d 组与对照组比较 P < 0. 05) ; ( 2) 探究行为: 组间比较差异有显著性 (P < 0. 01) 。术后 1d 较对照组大幅减少( P < 0. 01 ) , 3d 、 5d 接近对照组水平 ( P > 0. 05, 与1d 、 7d 、 14d 、 21d 组比较 P < 0. 01 ) , 此后逐渐降至较低水平 ( 与对照组比较 P < 0. 01) ; ( 3) 穿梭距离: 组间比较差异有显著性 ( P < 0. 01) 。实验组变化趋势呈正态分布, 1d 、 14d 、 21d 组与5d 组及对照组比较差异有显著性 (P < 0. 01) , 5d 组与对照组比较差异无显著性 ( P > 0. 05 ) ; ( 4) 下肢站立: 组间比较差异有显著性 (P < 0. 01) 。各实验组与对照组比较差异均有显著性 (P < 0. 01) , 3d 、 5d 组也有恢复倾向 ( 与 1d 、21d 组比较 P < 0. 05 ) , 但与对照组相比仍处于较低水平; ( 5) 修饰行为: 变化没有规律性, 组间比较差异

无显著性 (P > 0. 05) 。

2. 2　形态学观察结果　 ( 1) H E 染色和N issl 染色显示, 从 1d ～ 21d 大鼠 6-2 O HDA 注射侧SN c 区神经元较对侧明显减少, 尼氏体着色较对侧淡, 针道及毁损区可见不同程度胶质细胞浸润, 对照组左右侧细胞数均无明显变化。( 2) **组化染色显示 , TH 阳性神经元随时间推移逐渐减少, 毁损比例不断增大, 没有恢复倾向, 对照组无明显变化。( 3) 电镜结果从1 ～ 21d 大鼠黑质神经元超微结构损伤逐渐加重, 线粒体肿胀、嵴

消失, 粗面内质网和高尔基体也有肿胀; 21d 神经元水肿, 游离核糖体减少, 溶酶体增多; 在纹状体则有髓鞘松解断裂, 突触小泡多为清亮型, 颗粒小泡极少甚至看不见。

2. 3 　相关分析结果　旋转行为与黑质DA 能神经元毁损比例呈正相关 ( r = 0. 471, P < 0. 01) ; 探究行为、穿梭距离、下肢站立行为均与毁损比例呈负相关 ( r = - 0. 719 、 - 0. 594 、 - 0. 589, P < 0. 01 ) ; 修饰行为与毁损比例无相关性( r= - 0. 227, P > 0. 05) 。

　　3　讨　论

DA 作为内源性神经递质作用于基底核 ( basalgang lia) 的 D 1 、 D 2 受体, 平衡调节基底核为中心的直接和间接神经回路功能。基底核并不发布对肌肉收缩的命令, 而是通过选择不同的神经元发放电活动,参与随意运动的程序编制和运动程序的执行, 在调节运动的组成、方向、顺序、速度和幅度等方面发挥其作用。 PD 由于 SN c 区DA 能神经元退变, 导致纹状体DA 含量下降, DA 对间接回路的去抑制和对直接回路的兴奋两种功能严重丧失, 导致运动障碍。本实验的结果也显示, 实验组大鼠在毁损术后 1d 即有明显行为学改变, 其中旋转、探究、后肢站立和穿梭行为与黑质 DA 能神经元丢失比例有很好的相关性,而正常对照组和实验对照组大鼠的行为在实验前后没有明显改变。脑内DA 神经系统具有一定的代偿功能, 如 PD患者在出现临床症状时 SN c 区DA 能神经元丢失已达80% 以上, PD 模型大鼠由于 DA 受体超敏出现 DA激动剂诱导的旋转运动等。在尊龙凯时人生就是博的行为学实验中也观察到这种代偿现象, 开野实验的旋转、探究、后肢站立和穿梭行为指标在术后 3d 、 5d 有趋于改善的

倾向, 其可能机制: ( 1) DA 更新率增加, 残存的DA 能神经元合成和释放DA 的能力增强; ( 2)DA 受体超敏, 包括受体敏感性增强和受体数目的增加;( 3) 信号转导效率的增强, 如 Gs 蛋白上调, A C 酶活力提高, 细胞外信号调节蛋白激酶 ( ex tracellu larsignal2regu lated k inase, ER K ) 的活化等。尊龙凯时人生就是博的实验未发现修饰行为与黑质毁损比例有相关性, 但Ber r idge大鼠旷场实验与黑质多巴胺能神经元的相关性研究

指出纹状体在修饰行为的整合中起重要作用, 如果毁损双侧纹状体前外侧部, 则将打破修饰行为链。因此, 尊龙凯时人生就是博认为毁损一侧SN c 区只能导致一侧纹状体 DA 含量下降, 而健侧纹状体足以发挥代偿作用, 保持修饰行为链的完整性。另外, 可能与环境变化、手术损伤、麻醉等外界因素和观察时间不够也有一定的关系。6-O HDA 即 2. 4. 52 三羟基苯乙胺, 是一种选择性儿茶酚胺能神经元化学毁损剂, 单独或联合注射到大鼠 SN c 、内侧前脑束 ( M FB ) 、纹状体 (Cp u ) 、腹侧被盖区 ( V TA ) 等不同脑区, 选择性地毁损DA 和N E能神经元 ( 尤其对前者作用更显著) 制作不同程度损害的PD 模型。其作用机制是: 6-O HDA 通过多巴胺转运体进入 DA 能神经元, 快速氧化生成氧自由基( O 2-和·O H ) , 抑制线粒体氧化呼吸链复合物É , 并激活 casp ase 启动细胞凋亡, 从而导致黑质DA 能神经元丢失。在尊龙凯时人生就是博的实验中, 6-O HDA SN c 区注射后24h 即有50% 以上的DA 能神经元丢失, 而后随时间推移毁损比例不断增大。**组化切片经N issl复染发现, 非 DA 能神经元形态完整, 数量并不减少,在早期甚至有增多现象, 这说明 6-O HDA 是一种实用可靠的特异性 DA 能神经毒剂。但该法制作的模型仍属于急性损伤完全毁损模型, DA 神经元在注药后4h 即可见丢失。若用**诱导旋转实验作为鉴定标准, 一般为术后 2 ～ 3 周阳性, DA 神经系统毁损已相当严重, 不利于观察轻中度毁损模型。许多研究指出, 对轻中度毁损模型的研究更有助于对临床 PD 早期患者病理形态、神经生化和轻度行为异常的了解,有 助于 PD 病因、发病机制和**、细胞移植及基因**的研究。因此, 建立一个敏感反映轻中度毁损的行为学观测指标, 具有较大的现实意义。尊龙凯时人生就是博利用开野实验对毁损早期的大鼠进行行为学的观察, 发现术后 1d 各项指标即已发生明显改变, 并能很好地动态反映 DA 毁损程度。开野实验不仅适用于轻中度毁损模型的观测, 还能反映毁损早期机体的代偿情况,并且各参数间可相互佐证, *大程度地减少主观因素的影响。因此, 尊龙凯时人生就是博认为开野实验是一个很好的反映DA 神经系统毁损程度的行为学观察指标。大鼠旷场实验与黑质多巴胺能神经元的相关性研究。