摘要 本文观察了热应激预处理对脑缺血 / 再灌注昆明小鼠海马神经元的保护作用。实验采用昆明小鼠以双侧颈总动脉夹闭7 m i n后再通制作脑缺血 / 再灌注模型 ,在缺血 / 再灌注前予以热应激预处理。 根据不同的处理方法将动物随机分为四组 : ( 1 ) 正常对照组 , ( 2 )热应激预处理后缺血再灌注组 ( HS / I R ) , ( 3)缺血再灌注组 ( I R ) , ( 4 )单纯热应激组 ( HS) ,后 3 组又分别分为 1 d 、4 d和 14 d三个亚组。水迷宫检测小鼠学习记忆的行为改变 , **组织化学染色结合图像分析技术检测缺血 / 再灌注对海马C A1 区神经元微管相关蛋白 2 2 (MAP-2 ) 的影响 , N issl染色计数 C A1 区神经元的数目。结果表明 : 与正常组、 HS 和 HS / I R 组比较 , I R组小鼠水迷宫检测逃避潜伏期增加 ( P < 0 . 01 ) ,其搜索策略以边缘式和限制式为主 ,而其它三组搜索策略则以趋向式和直线式为主。N issl染色显示 I R组和 HS / I R组海马锥体细胞减少 ,且 I R组细胞丢失比 HS / I R组更多 ( P < 0 . 05 ) ; MAP-2 **组化染色显示 4 d时海马 C A1区辐射层的树突发生紊乱和断裂 , MAP-2 有明显减少 ( P < 0 . 05 ) , 14 d时 I R组 MAP-2 阳性表达主要聚集于胞浆中。以上实验结果提示 ,热应激预处理可以通过对海马神经元的保护作用改善动物脑缺血 / 再灌注引起的学习记忆能力的下降。
关键词 热应激 Morris水迷宫 微管相关蛋白 2 2 缺血 / 再灌注 海马
微管相关蛋白-2 ( microtubule associated protein2 , MA P-2 )是细胞骨架蛋白的一种 , 主要位于神经元的树突内 ,对稳定微管结构的完整性具有重要作用 ,同时可介导神经细胞内微管与其它细胞器间的相互作用 , 与神经细胞的正常功能密切相关。MA P-2对脑缺血所导致的损伤很敏感 , 常作为缺血损伤的主要指标 。海马是缺血损伤敏感区 , 而海马与情绪 、 学习和记忆等脑的**功能密切相关 ,因而缺血性脑损伤也将导致学习和记忆功能 , 特别是空间辨别功能的障碍 。
近年发现经过预处理的组织器官对随后严重损伤的耐受性明显增强 ,这种现象称之为预适应 ,如缺血预适应 、 热应激预适应等 。热应激能对器官起保护性作用的现象早已被人们所发现 , 其中**性热水浴在中国 、 日本 、 芬兰等国家广泛被使用。有实验研究表明热应激预适应能增强心脏组织对缺血的耐受性 ,但热应激预处理是否对因缺血所致的脑 ,特别是海马神经元损伤具有类似的保护作用 , 尚未见文献报道。本实验采用双侧颈总动脉夹闭制作昆明小鼠脑缺血 / 再灌注模型 ,观察热应激预处理对小鼠学习 、 记忆和海马神经元的影响 ,探讨热应激预处理对缺血脑组织的保护作用 。
材料和方法
1 . 实验动物及分组
健康 6 月龄昆明小鼠 72 只 ( 雌雄不限 ) , 体重( 40 ± 5 ) g,由中南大学实验动物学部提供 。实验动物依据不同的处理方法分为 4 组 : ( 1 ) 正常对照组(No r m a l , n =18 ) ; ( 2 ) 热应激预处理后缺血再灌注组 ( HS / I R , n = 18 ) ; ( 3 ) 缺血再灌注组 ( I R , n =18 ) ; ( 4 ) 单纯热应激组 ( H S, n = 18 ) 。H S组 、 I R 组和 H S / I R 组又分为 1 d 、 4 d 、 14 d 三个亚组 ( n = 6 / 亚组 ) 。
2 . 试剂
大鼠抗 MAP-2单克隆抗体购自 Sternberger Monclonnals公司 ,羊抗鼠 I gG 、ABC试剂盒购自美国V ector 公司 , DAB、 Triton X-100 购自 Sigma 公司 ,30 % H2O2 为上海桃浦化工厂产品 。
3 . Morris水迷宫测试
水迷宫购自上海尊龙凯时人生就是博信息科技有限公司，材质采用ABS工程塑料（汽车、飞机外壳材质）模具制作，水池上空通过一摄像机和计算机相连接. 水池直径约160cm ,深约50cm ,站台高度 29c m ,池内容自来水 ,水深 30 c m ,并用不透明的大小均匀的白色塑料泡沫覆盖 ,液面距池壁上缘 20 c m , 水温保持在 ( 22～26 ) ℃ 。 将圆池分为东南 、 东北 、 西南 、 西北 4 个象限 ,站台位于其中任一象限内 , 距圆心 24 c m , 站台顶端平面位于液面下 1 c m 。 圆池置于光线良好
的实验室内 ( 3 m × 5 m ) ,包括相对固定的迷宫外视觉线索 ( 工作台 、 椅子 、 门 、 窗 、 书架及电灯等 ) 。每只动物每天训练 4 次 , 历时 3 d,全部行为学训练均在 10 ∶ 00 a m ～5 ∶ 00 p m 之间完成 。逃避潜伏期 : 检测时将小鼠头朝池壁轻轻放入水中 ,同时开始计时 ,动物自入水后至找到平台后四肢爬上平台所需时间作为逃避潜伏期 。搜索策略 : 观察动物入水后寻找站台的游泳轨迹以确定其搜索策略 。记录小鼠后 8次测试潜伏期 , 计算其均值 , 以平均潜伏期的 90 %区间作为筛选学习记忆功能正常小鼠的标准 , 若未能达到此要求的动物则弃去不用 。 在各组动物处理后各时间点再作水迷宫检测 , 比较各组动物处理前后潜伏期的差别以及游泳轨迹的改变 。
4 . 动物模型制作
4 . 1 热应激动物模型 H S 、 HS / I R 组的小鼠用2 %****钠 ( 2 m g / kg) 腹腔注射麻醉 ,置于带鼓风装置且具有适当湿度的烤箱内 , 当小鼠的体温升至 ( 42 . 0 ± 0 . 5 ) ℃ ( 肛温 ) 时维持 15 m i n, 然后到常温环境 下 恢 复 1 h, 再 次 升 高 体 温 至 ( 42 . 0 ± 0 .5 ) ℃,反复 3次 。
4 . 2 脑缺血 / 再灌注动物模型 H S / I R、 I R 组的小鼠行缺血 / 再灌注处理 , 其中 HS / I R 组的动物于热应激预处理后 24 h再实施以下操作 : 用 2 %****钠 ( 2 m g / kg) 腹腔注射麻醉 , 仰卧固定于手术台上 ,颈前正中切口 , 钝性分离双侧颈总动脉 , 微动脉夹夹闭双侧颈总动脉 7 m i n,小鼠在夹闭双侧颈总动脉 60 s内昏迷 ,翻正反射消失 ,双侧瞳孔放大 ,动物瞳孔在缺血时变为苍白并于整个缺血期维持不变 ,但能自主呼吸 。实验中保持小鼠体温在 ( 37 . 0± 0 . 5 ) ℃ ( 肛温 ) ,未昏迷的动物说明未达到损伤的
要求 ,不予采用 。 脑缺血 7 m i n后解除动脉夹 ,恢复脑血流 。 再灌注后瞳孔颜色立即转变为鲜红色 , 分别于再灌注后 1 d 、 4 d 、 14 d处死动物 。 各组动物在各种处理前作 Mo rris水迷宫测试 , 以比较不同处理方法对学习记忆的影响 。
5 . 组织制备
用 2 %****钠 ( 2 m g / kg) 腹腔注射麻醉动物 ,开胸后于动物左心室插管至升主动脉 ,剪开右心房 ,先灌注生理盐水 30 m l , 随后灌注 4 ℃ 预冷的含4 %多聚甲醛的磷酸缓冲液 ( 0 . 1 mo l /L , pH 7 . 4 ) 60923 王春旭等 : 热应激对小鼠海马神经元的保护作用
m l 。 恒温切片机作连续冠状切片 , 片厚 30 μ m , 取海马和齿状回平面 。
6 . **组织化学
切片依次经以下处理 : 0 . 01 mo l /L P B S洗 5 m i n× 3次 , 1 % H2 O2 室温下处理 30 m i n; 再次用 P B S洗5 m i n × 3 次 , 0 . 3 % Trit on X2 100 + 5 % B S A 室温封闭 1 h; 加大鼠抗 MA P2 2 单克隆抗体 ( 1 ∶ 5000 ) , 4 ℃孵育 24 h; 加生物素化羊抗大鼠 I gG ( 1 ∶ 200 ) , 室温孵育 2 h; 加生物素 - 卵白素 - 辣根过氧化物酶复合物 (ABC, 1 ∶ 150 ) , 室温下孵育 1 ～1 . 5 h 。各抗体转换时均用 P B S洗 5 m i n × 3 次 ; 0 . 05 % DAB + 0 . 01 %H2 O2 避光呈色 ,镜下控制反应深度 。贴片 、 常规脱水 、 透明 、 封片 。O l y mp u s显微镜观察并拍片 。阴性对照中以 P B S代替一抗 ,结果为阴性 。
7 . N issl 染色
常规 N issl 染色 ,用以计数海马 C A1区神经元 。
8 . 数据收集处理
光学显微镜下观察并计数海马 C A1 区神经元 。用 H P I A S高清晰度彩色病理图像测量系统测定海马 C A1 区神经元胞浆 MA P2 2 阳性表达产物的平均灰度值 ( 自动矫正背底灰度值 ) , 数值越大表明灰度越低 。 每例标本检测 3 张切片 , 每张切片检测 3 个视野 。 实验数据用 SPSS 10 . 0 统计软件分析 , 样本均数的比较采用成组设计多个样本均数比较的单因素方差分析 。 P < 0 . 05 为差异有统计学意义 。
结 果
1 . 行为学检测
正常对照组小鼠的逃避潜伏期时间比较稳定 ,在 20 s左右可找到平台 ; H S组和 H S / I R 组小鼠的逃避潜伏期时间与正常组比较略有增加 , 且波动较大 ,但无统计学意义 ( P > 0 . 05 ) 。处理后 14 d, 记录各组动物搜索策略显示上述 3组动物均以直线式和趋向式搜索策略为主 , 边缘式的搜索策略少 。而I R 组小鼠在再灌注后 4 d 和 14 d 的逃避潜伏期显
著增加 ,与正常对照组 、 HS组 、 H S / I R 组相比逃避潜伏期明显延长 ( P < 0 . 01 ) , I R 组搜索策略也转变为边缘式和限制式为主 。
2 . N issl 染色结果
在 N issl染色的切片上 ,正常对照组和 H S组小鼠海马 C A1区神经元的形态没有明显的差别 ,均可见数层锥体细胞排列整齐规则 ,胞浆染色清晰 ,胞核淡染 ; 而 I R 组和 HS / I R 组海马 C A1 区锥体神经元胞体肿胀 ,排列散乱 , 细胞间距加大 , 锥体神经元数目减少 ( F i g . 1 A 2 D ) 。小鼠海马 C A1 区存活锥体细胞计数表明 , 4 d后 HS / I R 组和 I R 组神经元数较正常组和 H S组明显减少 ( P < 0 . 01 ) ; 4 d 和 14 d I R组神经元数与 H S / I R 组比较锥体细胞进一步减少( P < 0 . 05 ) 。
3 . MA P-2**组织化学染色结果
正常组与 HS组的 MA P-2**阳性产物在形态和分布上相似 , MA P-2 阳性的树突平滑 、 完整 , 而核周 MA P-2阳性产物较弱 ; 4 d I R 组海马 C A1 区辐射层 MA P-2阳性产物减弱 ,突起断裂 ,螺旋化改变 ;而 HS / I R 组辐射层 MA P-2 表达与正常组相似 ; 14 d的 I R 组观察到海马 C A1 区锥体神经元树突 MA P-2几乎消失 ,而在核周有 MA P-2聚集 ( F i g . 1 E～ I ) 。 采用平均灰度值表示 MA P2 2 的阳性**产物 , 反应产物少的平均灰度值高 。 与正常组 、 HS组和 H S /I R 组比较 , 4 d 的 I R 组海马 C A1 区辐射层 MA P-2阳性产物减弱 ( P < 0 . 05 ) 。
讨 论
1 . 热应激预处理对动物行为学的影响
学习记忆行为学检测方法主要有 Y迷宫 、 水迷宫 、 跳台实验 、 避暗实验等 , 而 Mo rris水迷宫因其操作简便 ,可记录指标较多而成为应用*为广泛的一种 。 本实验采用昆明小鼠手术前后 Mo rris水迷宫测试来评估处理因素对学习记忆能力的影响 。 结果表明 ,与 HS组 、 H S / I R 组和正常组比较 , I R 组小鼠逃避潜伏期明显下降 ,而且 I R 组小鼠的搜索策略也相应地发生了变化 ,由正常组的直线式为主转变为边缘式和随机式为主 , 表明小鼠的空间辨别和记忆能力下降 。HS组和 HS / I R 组动物的直线式搜索策略相对减少 ,而趋向式的搜索策略比对照组相对增加 ,可能是因为直线式搜索策略需要**的记住平台所在的位置 。 任何对方向的不确定和对平台位置的犹豫都可能导致搜索方式从直线式变为趋向式 。 但是采用直线式和趋向式搜索策略的小鼠都具有较好的记忆能力。 本实验的结果提示 HS组和 HS / I R 组小鼠的记忆能力好于 I R 组小鼠 ,即热应激预适应对因脑缺血所致的学习记忆功能障碍具有一定的保护作用 。热应激对小鼠海马神经元的保护作用
2 . 热应激预适应与海马神经元骨架蛋白
脑缺血时 , 海马 C A1 区为易损区 , C A3 区为相对耐受区。神经元骨架蛋白是缺血损伤敏感的指标 ,其完整性对维持神经元的形态和功能有重要作用 。 微管相关蛋白-2 (MA P-2 ) 是神经元内重要的细胞骨架蛋白成分 , 在神经元发育 、 分化 、 可塑性方面起着主导作用。MA P-2 有许多重要功能 , 包括快速轴浆运输与神经递质释放 , 神经元发育过程中的构型与稳定等 。MA P-2 的形态和结构的损坏可以导致神经元的功能障碍 , 甚至神经元死亡。电镜观察表明 ,即使短暂缺血也会引起细胞骨架的紊乱及蛋白成分不可逆变性 , MA P-2 对脑缺血易敏感 ,常作为缺血诱导神经元损伤的早期标记物。热应激对小鼠海马神经元的保护作用
本实验表明 ,正常对照组海马 C A1区 MA P-2 **阳性的树突平滑且完整 , 直径均匀 ; 而脑缺血 / 再灌注后 4 d, MA P-2 **阳性的树突出现断裂 、 螺旋化改变 , 海马 C A1 区辐射层 MA P-2 表达明显减弱( P < 0 . 05 ) 。 这种现象在本室以前的研究中也得到了证实。 经过热应激预处理脑缺血 / 再灌注后 4d,海马 C A1 区神经元的树突结构没有发生明显断裂 、 螺旋化改变 ; H S / I R 组辐射层 MA P2 2 与正常组比较无明显差别 ,同时神经元的数量也无明显丢失 ,提示热应激预适应可以使神经元骨架蛋白成分免受缺血损伤 。缺血性脑损伤后 , 除了存在一种主动性的程序性细胞死亡 ( 凋亡 )过程 , 在耐受细胞内还存在一种主动性神经元存活过程。14 d的 I R 组观察到海马 C A1 区锥体神经元树突 MA P-2 几乎消失 ,而在核周有 MA P-2聚集 。本室以前的研究证明随着脑缺血再灌注时间的延长 , MA P-2 在神经元内分布的改变 : 树突内的 MA P-2 表达减少 , 转而出现胞浆内的表达增加 ,推测细胞开始合成新的微管蛋白 ,参与细胞的主动性修复 ,维持细胞的存活。总之 ,热应激可改善小鼠空间学习记忆能力 ,这可能与热应激减少 C A1 区神经元丢失 ,保护 MA P-2免受缺血损伤有关 ,其机制有待深入研究 。