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Morris水迷宫在血管性痴呆大鼠海马中的影响

Morris水迷宫在血管性痴呆大鼠海马中的影响
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验动物健康SPF 级Wistar 大鼠80 只,购自南方医科大学动物实验中心,体重200 ~ 250 g,雌雄比例为1∶ 1,所有实验大鼠饲养于广州**广州总医院动物中心,饲养房内温度( 22 ± 3) ℃,湿度60%,5 只/笼,光/暗周期为12 h /12 h,实验期间自由获取水及标准颗粒饲料。
1. 1. 2 主要试剂兔抗鼠5-HT6司,Envision 二步法检测试剂盒购自Dako 公司,二氨基联苯胺( DAB) 试剂购自福州迈新生物公司,其余化学试剂均为分析纯级。
1. 1. 3 主要仪器Morris 大鼠水迷宫,SuperMaze 动物行为学视频分析系统( 上海尊龙凯时人生就是博信息科技) ,日本Olympus BX-51 显微镜, ImagePro plus 病理图文分析系统。
1. 2 方法
1. 2. 1 动物分组及模型制作所有大鼠适应性饲养1 w 后随机分成两组,VD 组50 只,假手术组( SO 组) 30 只。动物术前禁食、禁水4 h,称重后以10%水合氯醛按350 mg /kg 体重腹腔注射麻醉,将大鼠仰卧位固定后常规**颈部手术区域,在颈前正中作一长约1 cm 的纵形切口,钝性分离皮下软组织、颈前肌群,在气管的侧后方找到颈动脉鞘,分离颈总动脉与迷走神经,以1 号丝线长久性结扎颈总动脉,同法结扎另一侧颈总动脉,局部**后恢复组织层次并缝合皮肤。SO 组大鼠除不结扎双侧颈总动脉外,其余操作与VD 组大鼠一致。术后动物另放于干净鼠笼饲养,自由获取水源及饲料。
1. 2. 2 动物行为学观察( Morris 水迷宫实验) 大鼠Morris 水迷宫为一内径160 cm、高50 cm 的圆形水池,水池内壁被漆成黑色,池壁上黏贴不同形状的空间标记物,一个直径为12 cm的逃生平台固定于水池中的某一象限( 即目标象限) ,进水后水面高出平台约1 cm,水池上方横架安装连接计算机显示系统的摄像仪。
SO 组和VD 组大鼠分别在双侧颈总动脉阻断术后4、8 w进行Morris 水迷宫实验,第1 ~ 4 天( 即trial 1、trial 2、trial 3、trial4) 将大鼠从四个不同象限面向水池壁放入水中,大鼠找到逃平台后终止信息采集,*长采集时间为120 s,若超过120 s大鼠仍未能找到平台,则将其引导至逃生平台并在平台上站立20 s 以使其形成对空间参照物的记忆,每只大鼠如此训练4次/d,每次训练之间有15 s 间歇以便休息,连续训练4 d,记录大鼠找到平台的逃避潜伏期评估其空间学习能力; 第5 天将逃生平台从水池中撤去,将大鼠从四个不同象限投入水中,记录60 s 内大鼠在目标象限搜寻的时间,以此评估大鼠的空间记忆能力。每天固定在8: 00 ~ 17: 00 进行水迷宫实验,实验过程中保持房间内光照恒定并且无光线直射于水面,水温控制在26℃左右,迷宫外参照物保持不变。1. 2. 3 组织标本固定、制片、染色每组各取5 ~ 6 只大鼠分别在术后的相应观察终点麻醉动物,以4℃预冷4% 多聚甲醛溶液经心脏灌注固定,断头取脑后从视交叉后2 ~ 3 mm 处冠状位切取厚度约3 mm 的脑组织,放入10% 中性甲醛溶液中固定24 h。在自动脱水机中梯度酒精脱水、透明、浸蜡后包埋,蜡块组织作连续冠状切片,厚度2 ~ 3 μm。石蜡切片脱蜡、水化后分别进行苏木素-伊红( HE) 染色和Nissl 染色,在光学显微镜高倍镜( × 400) 下观察海马CA1 区锥体细胞计数及形态。
1. 2. 4 **组化显色分析海马CA1 区5-HT6受体的分布与表达石蜡切片经脱蜡、水化,置于pH6. 0 的柠檬酸盐中高压修复; 0. 01 mol /L PBS 冲洗5 min × 3 次,3% 过氧化氢溶液避光孵育10 min 以阻断内源性过氧化物酶,0. 01 mol /L PBS 冲洗5 min × 3 次,切片滴加兔抗鼠5-HT6受体多克隆抗体( 1∶ 1 000
稀释) ,置于湿盒内4℃ 冰箱中过夜孵育; 次晨取出切片0. 01 mol /L PBS 冲洗5 min × 3 次,滴加葡聚糖复合物( 二抗) ,室温下孵育40 min,0. 01 mol /L PBS 冲洗5 min × 3 次,滴加DAB 显色,显微镜下观察显色合适后流水冲洗终止反应,梯度酒精脱水、TO 生物透明剂透明,中性树胶封片后镜检观察。
1. 3 统计学方法应用SPSS13. 0 软件进行分析,计量资料采用x ± s 表示,两组独立样本均数比较采用t 检验,多个样本均数比较进行Levene 方差齐性检验,方差齐采用单向方差分析,方差不齐采用Brown-Forsythe 法; 平均逃避潜伏期和平均游泳速度在满足Mauchly 球对称检验时采用单个重复测量因素的方差分析,不满足Mauchly 球对称检验经Huynh-Feldt 系数校正自由度。
2 结果
2. 1 大鼠Morris 水迷宫结果术后4、8 w,SO 组和VD 组大鼠在定位航行试验中的平均游泳速度均无明显统计学差异( P > 0. 05) 。术后4 w 和8 w,VD 组大鼠与同时间点SO 组大鼠平均逃避潜伏期比较均明显延长( P < 0. 001) ,提示VD 组大鼠在术后无明显运动功能障碍,但存在空间学习能力减退,而且学习能力下降随脑缺血时间延长加重。术后4 w 空间探索试验中,SO 组和VD 组大鼠目标象限的平均搜寻时间比较具有统计学差异( P < 0. 001) ,提示VD 组大鼠空间记忆能力下降。
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